微胶质细胞来源的纳米囊泡同步激活巨自噬与分子伴侣介导的自噬治疗阿尔茨海默病

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Microglia-derived nanovesicles synchronize macroautophagy and chaperone-mediated autophagy for Alzheimer’s disease therapy

本研究针对阿尔茨海默病（AD）中自噬通路双重失调的难题，开发了基于微胶质细胞-脂质体融合挤出技术（MiLi-FE）的仿生纳米囊泡AR@ENV，可同步递送CMA诱导剂AR7和巨自噬诱导剂雷帕霉素。该载体高效穿越血脑屏障，靶向AD脑内炎症区域，通过协同激活CMA（拮抗RARα）和巨自噬（抑制mTOR）增强Aβ清除、改善线粒体功能，并在两种AD模型小鼠中显著逆转认知缺陷。该策略为神经退行性疾病提供了兼具靶向性与协同治疗潜力的新技术平台。

　　

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）作为最常见的神经退行性疾病，其病理特征包括β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成的老年斑和过度磷酸化tau蛋白导致的神经纤维缠结。现有疗法如乙酰胆碱酯酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂仅能缓解症状，而新兴的抗Aβ单抗虽能延缓疾病进展，却因血脑屏障（BBB）穿透性差、对tau病理作用有限等问题面临挑战。更关键的是，AD早期即出现自噬系统功能紊乱，尤其是巨自噬（macroautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy, CMA）双重失调，导致毒性蛋白聚集无法有效清除，加速神经元损伤。然而，如何同时调控这两条自噬通路并实现精准脑内递送，一直是AD治疗领域的瓶颈。

为解决这一难题，四川大学华西药学院李敏团队开发了一种创新策略——利用微胶质细胞来源的纳米囊泡同步激活巨自噬与CMA。研究团队首先证实了AD模型小鼠（APP/PS1）脑中CMA关键蛋白Lamp2A表达下降，巨自噬标志物LC3BII/LC3BI比率降低且p62积累，表明自噬功能早期受损。为突破BBB递送障碍，他们建立了微胶质细胞-脂质体融合挤出技术（Microglia-Liposome Fusion Extrusion, MiLi-FE），将疏水性药物AR7（CMA诱导剂）和雷帕霉素（mTOR抑制剂）分别封装于脂质体后，通过微胶质细胞内吞与膜融合，经纳米孔挤出制备出双药共载的仿生纳米囊泡AR@ENV。该载体不仅保留微胶质膜蛋白（如CX3CR1），具备高效BBB穿透和神经元靶向能力，还能通过下调内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1增强跨膜转运。

关键技术方法包括：通过MiLi-FE技术构建载药纳米囊泡；利用体外BBB模型（bEnd.3细胞）和AD小鼠模型评估囊泡的穿透性与靶向性；采用蛋白质组学分析囊泡膜成分；通过Western blot、qPCR、免疫荧光等手段检测自噬通路活性；结合Morris水迷宫、Y迷宫等行为学实验验证认知功能改善。

研究结果

自噬功能障碍在AD模型小鼠中的验证

在APP/PS1小鼠脑中，CMA相关蛋白Lamp2A表达显著降低，同时LC3BII/LC3BI比率下降且p62积累，提示巨自噬与CMA均受损。体外实验中，Aβ_1-42寡聚体处理虽抑制巨自噬，但不影响CMA，说明自噬紊乱早于Aβ沉积，且Aβ可能加剧巨自噬障碍。

基于MiLi-FE的AR@ENV制备与表征

通过MiLi-FE技术成功制备出粒径约134 nm、具有典型碟状形态的AR@ENV，其囊泡产率较天然外泌体提高33.8倍，且高表达微胶质细胞特异性蛋白CX3CR1。蛋白质组学分析显示AR@ENV富含膜靶向蛋白，支持其神经元导向功能。

AR@ENV增强自噬并发挥神经保护作用

在Aβ_1-42诱导的HT22神经元损伤模型中，AR@ENV处理显著提升细胞存活率，并同步上调Lamp2A（CMA激活）和LC3BII/LC3BI比率（巨自噬激活），同时降低p62。透射电镜显示AR@ENV促进自噬体形成，且通过抑制mTOR通路基因表达、增强线粒体-溶酶体共定位，恢复线粒体膜电位，证实其通过调控自噬缓解氧化应激与神经元凋亡。

微胶质细胞来源的ENV促进BBB穿透与神经元靶向

体外BBB模型表明，ENV在Aβ_1-42诱导的炎症条件下穿透效率更高，且主要被神经元而非微胶质细胞内化。Evans蓝实验证实AR@ENV引起的BBB开放短暂可逆，24小时后即恢复完整性。

体内分布与脑靶向

活体成像显示ENV-DiD在AD模型小鼠脑中富集程度显著高于健康对照，且优先定位于海马区神经元。免疫荧光进一步验证ENV与神经元标志物NeuN共定位，而非小胶质细胞标志物Iba-1。

AR@ENV改善AD模型小鼠认知缺陷

行为学实验表明，AR@ENV治疗显著缩短APP/PS1小鼠在Morris水迷宫中的逃避潜伏期，增加平台穿越次数，恢复Y迷宫自发交替率，并提升新颖物体识别指数与筑巢能力，证实其全面改善空间学习、记忆及焦虑样行为。

AR@ENV增强自噬并赋予AD小鼠神经保护

AR@ENV处理上调小鼠脑内Lamp2A与LC3BII/LC3BI比率，降低p62及炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β），减少M1型小胶质细胞活化，并显著保护海马CA1/CA3区神经元完整性，同时降低Aβ斑块负荷。

AR@ENV的生物相容性

溶血实验与细胞毒性测试显示AR@ENV安全性良好，长期给药未引起主要器官病变或免疫反应，且可缓解游离药物的肝毒性。

结论与意义

本研究通过MiLi-FE技术构建的AR@ENV纳米平台，首次实现了双自噬通路（CMA与巨自噬）的同步激活与靶向递送，有效清除了Aβ等毒性蛋白，逆转了AD模型中的神经炎症与认知衰退。该策略不仅为AD提供了兼具疾病修饰潜力和临床转化前景的新方案，其仿生递送平台还可拓展至其他自噬相关神经退行性疾病的治疗中。