基于表面三步PCR平台的高校环境中多种呼吸道病毒RNA同步检测及传播风险评估

《Scientific Reports》：Simultaneous detection of respiratory virus RNA on environmental surfaces in a university setting by a sensitive Surface 3-Step PCR platform

本研究针对高校环境中呼吸道病毒通过气溶胶和污染物传播的风险，开发了一种高灵敏度的表面三步PCR检测平台。研究人员在意大利中部大学校园内，通过多点纵向采样，同步检测了SARS-CoV-2、流感病毒（Flu A/B）和呼吸道合胞病毒（RSV A/B）的RNA污染情况。结果显示，400份环境样本中16%呈病毒RNA阳性，且病毒污染率与教室规模呈负相关（小教室22% vs 大教室11%）。该平台通过引入合成RNA内参（IPC）和人类内源基因（RNase P、Rpp40）双重质控，将检测灵敏度提升至98%，为高校等非医疗场所的早期预警和精准干预提供了技术支撑。

在新冠疫情之后，全球对呼吸道病毒的传播机制有了更深刻的认识。病毒不仅通过飞沫和空气传播，还能在物体表面存活数小时至数天，成为潜在的传染源。高校作为人员密集的公共场所，教室、食堂、公共设备等高频接触表面可能成为病毒传播的“隐形温床”。然而，目前大多数环境监测研究集中于医疗机构，对非医疗环境（尤其是高校）的病毒污染系统性研究仍较缺乏。此外，传统检测方法在低病毒载量环境下易出现假阴性，且缺乏多病毒同步检测能力，难以满足常态化监测需求。

针对这一挑战，意大利乌尔比诺大学的研究团队在《Scientific Reports》上发表了一项创新性研究。他们开发了一种名为“表面三步PCR”（Surface 3-Step PCR）的高灵敏度检测平台，首次在高校环境中同步监测SARS-CoV-2、流感病毒（Flu A/B）和呼吸道合胞病毒（RSV A/B）的表面污染动态。研究团队于2023年11月至2024年2月期间，分三个时间点（T1：学期末；T2：考试周；T3：新学期初）在校园内采集了400份高频接触表面样本（如课桌、讲台、门把手等），通过多重分子检测和严格质控体系，揭示了病毒污染的空间分布和时间变化规律。

关键技术方法包括：

1. 1.
   标准化表面采样：使用合成纤维拭子对100 cm²表面进行标准化涂抹，样本保存于含胍盐的病毒运输介质中。
2. 2.
   核酸提取与质控：采用柱式提取法，并添加合成RNA作为内部过程控制（IPC），监测提取效率及PCR抑制物。
3. 3.
   多重实时PCR检测：依次使用三种检测体系——SARS-CoV-2特异性检测（靶向RdRp基因）、多病毒联检试剂盒（靶向SARS-CoV-2的ORF1b/N基因、Flu A/B的M1/NS2基因、RSV A/B的M基因）以及SYBR Green qPCR（检测人类Rpp40基因作为内源参比）。

病毒污染的时间动态

研究发现在三个采样时间点中，病毒RNA总阳性率从T1的20%下降至T3的8%，其中SARS-CoV-2是主要污染物（占总阳性样本的14%）。值得注意的是，流感病毒和RSV的检出集中在冬季高发期（T2和T3），与流行病学季节特征一致。进一步分析显示，SARS-CoV-2的Ct值随时间显著上升（p=0.0199），提示病毒载量逐步降低。

检测平台的可靠性验证

通过引入三重质控系统（IPC、RNase P、Rpp40），研究将无效样本率从7.8%降至2.3%，最终实现98%的检测灵敏度。其中，人类内源基因（RNase P和Rpp40）的扩增成功弥补了合成IPC在部分环境样本中的不稳定性，显著降低了假阴性风险。

污染的空间分布特征

病毒污染率与教室规模密切相关：小教室（容纳<40人）的阳性率最高（22%），中等教室（14%）和大教室（11%）依次递减。从具体位置看，学生课桌和教师讲台是污染热点（分别检出39例和18例阳性），而厕所、自动售货机按钮等区域未检出病毒，可能与清洁频率和人员停留时间差异有关。

多靶标检测的互补性

研究还发现，针对SARS-CoV-2的两个检测靶标（RdRp和ORF1b/N）结果存在部分差异：40.7%的阳性样本仅被RdRp检测到，29.6%仅被ORF1b/N检测到。这种差异可能与病毒RNA降解或引物结合效率有关，凸显了多靶标联合检测在低载量环境样本中的必要性。

本研究通过高灵敏度分子监测平台，证实了高校环境中呼吸道病毒表面污染的普遍性和动态变化。小教室和课桌等高频接触区域是干预重点，而冬季学期初和考试周是强化清洁的关键时段。该策略不仅为高校疫情防控提供了数据支持，更开创了非医疗场所病毒环境监测的新范式。未来，将此类监测与流行病学数据结合，可构建更精准的早期预警系统，尤其在保护易感人群和降低聚集性感染风险方面具有重要价值。