SARS-CoV-2 NSP14抑制剂C10的发现：靶向病毒RNA加帽机制的新型广谱抗病毒策略

《Nature Communications》：SARS-CoV-2 NSP14 inhibitor exhibits potent antiviral activity and reverses NSP14-driven host modulation

本研究针对SARS-CoV-2耐药变异株的临床挑战，聚焦病毒非结构蛋白NSP14的N7-甲基转移酶（N7-MTase）功能，通过结构导向的虚拟筛选和理性药物设计，开发出高选择性非核苷类抑制剂C10。该化合物能有效抑制SARS-CoV-2及其变异株的复制（EC50低至64 nM），并逆转NSP14介导的宿主转录组重编程和细胞周期阻滞，在转基因小鼠模型中显著降低肺部病毒载量。研究揭示了NSP14在病毒致病性中的新机制，为应对当前和未来冠状病毒威胁提供了新策略。

　　

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的持续变异对全球公共卫生构成长期威胁，尤其当病毒演化出对现有药物的耐药性时，临床治疗选择变得极为有限。目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物主要靶向病毒主蛋白酶（M^pro）或RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp），但耐药变异株已在患者中被发现。因此，迫切需要开发具有新作用机制的广谱抗病毒药物，以应对不断出现的病毒变异。

冠状病毒拥有一套独特的RNA加帽机制，通过在病毒RNA的5'端添加类宿主mRNA的帽结构，既能促进病毒蛋白翻译，又可帮助病毒逃避宿主天然免疫识别。SARS-CoV-2非结构蛋白14（NSP14）是一种双功能酶，同时具有3'-5'外切核糖核酸酶（ExoN）结构域和N7-甲基转移酶（N7-MTase）结构域。其中N7-MTase负责催化鸟嘌呤-N7位置的甲基化，这是病毒RNA帽成熟的关键步骤。研究表明，破坏NSP14的任一功能域都会严重损害病毒复制能力，使其成为极具潜力的抗病毒靶点。此外，单独表达NSP14就足以引起宿主转录组的广泛重编程，模拟SARS-CoV-2感染时的细胞变化，表明NSP14在病毒致病性中扮演着超越其经典功能的角色。

尽管NSP14的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）结合口袋与人类甲基转移酶存在显著差异，为高选择性药物设计提供了理想靶点，但此前报道的核苷类NSP14抑制剂在感染细胞中的效果有限，而非核苷类抑制剂则普遍存在效价低或选择性差的问题。直到最近，才有研究报道了首个靶向NSP14 RNA帽结合口袋的小分子抑制剂。然而，高效力、高选择性的非核苷类SAM结合口袋抑制剂，尤其是具有体内疗效的化合物，尚未见报道。此外，NSP14抑制剂对宿主-病毒互作的影响及其机制仍不清楚。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员通过结构导向的虚拟筛选，发现了一类新型非核苷类SARS-CoV-2 NSP14抑制剂，其先导化合物C10能特异性占据NSP14的SAM结合位点。研究不仅证实了C10强大的抗病毒活性，还深入揭示了抑制NSP14带来的多重抗病毒效应，包括抑制病毒翻译、激活免疫刺激反应以及逆转宿主转录组调控。

为开展这项研究，研究人员应用了几项关键的技术方法：他们利用基于结构的虚拟筛选从约15万个小分子中初筛候选化合物；通过甲基转移酶发光法（MTase-Glo）和薄层色谱法（TLC）进行酶活抑制评价；采用差示扫描荧光法（DSF）和表面等离子共振（SPR）技术验证化合物与靶点的结合模式和亲和力；借助分子动力学模拟和氢氘交换质谱（HDX-MS）解析结合细节；在细胞水平使用假病毒系统（trVLP）和复制子系统评估抗病毒活性及作用阶段；通过多核糖体图谱分析研究病毒翻译抑制；利用RNA测序（RNA-seq）分析宿主转录组变化；并在K18-hACE2转基因小鼠模型上进行了体内药效验证。

Discovery of NSP14 inhibitors by structure-guided virtual screening

研究人员首先通过靶向NSP14的SAM结合口袋（PDB ID 7R2V）进行虚拟筛选，从约15万个小分子中筛选得到先导化合物C1（IC₅₀ = 3.25μM）。经过结构优化得到效力提升10倍的C3（IC₅₀ = 0.32μM），并最终开发出先导化合物C10。薄层色谱分析证实，C10能以剂量依赖的方式抑制NSP14介导的m⁷GpppG形成。

C10 is a selective inhibitor of betacoronavirus NSP14

C10对β属冠状病毒（如MERS-CoV、HCoV-OC43）的NSP14表现出广谱抑制活性，但对α属冠状病毒（HCoV-229E）的抑制活性显著降低（IC₅₀ = 9.11μM）。重要的是，C10对寨卡病毒NS5甲基转移酶及多种人类甲基转移酶（如METTL3/14、DNMT1、hRNMT）均无显著抑制作用，且不影响NSP14的ExoN活性，显示出优异的选择性。

Characterization of the inhibitory mode of lead compound

酶动力学分析表明，C10的IC₅₀值随SAM浓度增加而显著变化，但不受GpppG浓度影响，提示其为SAM竞争性抑制剂。DSF和SPR实验进一步证实C10直接结合NSP14（K_d = 187 nM），且该结合可被SAM或SAH（S-腺苷同型半胱氨酸）竞争性抑制，而GpppG或m⁷GpppG的存在则产生协同稳定效应，说明C10与RNA帽结合在相邻但不同的位点。

The SAR understanding of compound C10

分子对接和动力学模拟预测C10的核心结构与SAH高度重叠，但其三氟甲基苯基部分（R1）延伸至一个由Gln313、Asp331、Cys340和Trp385等残基构成的独特疏水口袋（称为Site-C）。点突变（Q313R、W385A）和HDX-MS分析验证了这些残基对C10结合的关键作用，而它们本身并不影响NSP14的固有催化活性。

C10 exhibits potent anti-viral activity in cell-based assays

细胞热转移实验（CETSA）证明C10能在细胞内与NSP14结合。在A549-ACE2细胞感染模型中，C10对SARS-CoV-2原始株、Delta和Omicron变异株均表现出纳摩尔到亚微摩尔水平的抑制活性（EC₅₀范围64.03-301.9 nM），选择性指数（SI）大于1500。连续传代实验筛选出耐药突变V290A和P393L，但竞争实验表明V290A突变会降低病毒适应性，提示其耐药代价。复制子实验和时间点添加实验证实C10主要作用于病毒复制阶段。

C10 suppresses viral translation and exhibits immunostimulatory effect

多核糖体图谱分析显示，C10处理并不全局破坏宿主翻译，但能显著减少病毒刺突（Spike）mRNA在重多核糖体组分中的富集，表明其通过抑制帽成熟特异性阻碍病毒蛋白翻译。同时，C10处理可诱导干扰素刺激基因（ISG）如RSAD2、IFI6、IRF7等的表达，产生免疫刺激效应。

C10 reverses NSP14-mediated host transcriptome modulation

RNA-seq分析发现，NSP14表达可导致675个宿主基因表达异常（511个上调，164个下调）。而C10处理能特异性逆转这些变化，其中被NSP14上调的基因（如细胞周期相关基因AURKA、免疫相关基因）被C10下调，反之亦然。值得注意的是，NSP14表达会诱导细胞G2/M期阻滞，而C10能以剂量依赖的方式缓解此现象，保护宿主细胞。

In vivo antiviral efficacy of C10

药代动力学研究显示C10在小鼠体内具有良好的暴露量（AUC = 37,779.33 ng·h/mL）。在K18-hACE2转基因小鼠感染模型中，C10（120 mg/kg）治疗可显著降低肺部病毒载量（log₁₀(PFU/g)从5.73降至4.99），减轻肺组织病理损伤和病毒抗原分布，其效果与阳性对照瑞德西韦（remdesivir）相当。

本研究成功开发出首个高效力、高选择性的非核苷类SARS-CoV-2 NSP14 SAM结合口袋抑制剂C10。该化合物通过竞争性占据SAM结合位点，抑制病毒RNA帽成熟，进而阻断病毒翻译和复制。研究首次揭示了C10还能逆转NSP14介导的宿主转录组重编程和细胞周期阻滞，展现了其直接抗病毒与调节宿主反应的双重机制。在转基因小鼠模型中的验证为其进一步开发奠定了坚实基础。由于RNA帽甲基转移酶在多种RNA和DNA病毒中高度保守，针对该靶点的抑制剂（如C10）不仅为应对当前SARS-CoV-2变异株提供了新策略，也为未来开发广谱抗病毒药物开辟了新的方向。该研究深化了对NSP14在病毒致病中作用的理解，凸显了靶向病毒帽合成机制的治疗潜力。