靶向长读长甲基化分析技术t-nanoEM：适用于临床样本的杂交捕获新方法

《Cell Reports Methods》：Targeted long-read methylation analysis using hybridization capture suitable for clinical specimens

为解决靶向长读长甲基化分析中目标位点有限、DNA输入量要求高等难题，Kunigo等开发了t-nanoEM技术。该技术将酶学转化（EM-seq）与杂交捕获相结合，仅需8 ng DNA即可实现目标区域的高深度（最高570×）甲基化分析，并成功应用于乳腺癌和肺癌临床样本的单倍型和突变等位基因特异性甲基化分析，为临床标本的表观遗传研究提供了有力工具。

在精准医疗时代，DNA甲基化作为重要的表观遗传标记，在癌症发生发展中扮演着关键角色。传统的短读长测序技术虽然能够检测甲基化状态，但在分析重复序列、复杂结构区域以及单倍型特异性甲基化等方面存在局限。而现有的长读长甲基化分析方法，如PCR、Cas9富集和自适应采样等，又面临着目标区域有限、DNA需求量高（数百纳克至数微克）等技术瓶颈，这使得临床样本（尤其是微量样本）的应用受到极大限制。

面对这一挑战，东京大学的研究团队在《Cell Reports Methods》上发表了他们的最新研究成果。他们开发了一种名为t-nanoEM（靶向nanoEM）的创新技术，将酶学甲基化测序（EM-seq）与杂交捕获技术巧妙结合，成功实现了对临床标本的高效靶向长读长甲基化分析。

研究团队采用了几项关键技术：首先改进了全基因组nanoEM方法（v.2版本），使用更温和的变性条件（66%甲酰胺，80°C）提高了文库复杂性和读长；其次开发了适用于转化后DNA的杂交捕获系统，使用Twist Bioscience平台并优化探针设计；建立了基于WhatsHap的单倍型分型流程，能够从转化后的长读长数据中解析等位基因特异性甲基化；最后将技术应用于临床乳腺癌和肺癌组织切片，通过显微切割获取特定区域进行多组学分析。

技术开发与优化

研究人员首先对原有的nanoEM方法进行改进，通过优化甲酰胺浓度和变性温度，显著提高了文库产量和复杂性。改进后的nanoEM v.2即使在1 ng输入DNA下也能获得优于旧版本的表现。随后，他们成功将杂交捕获系统整合到nanoEM流程中，建立了完整的t-nanoEM技术体系。该技术能够从10 ng输入DNA中获得N50长度为5-6 kb的读长，目标区域覆盖深度高达570倍，且与短读长EM-seq结果高度一致（R=0.87-0.91）。

技术性能评估

在乳腺癌细胞系（MDA-MB-231和BT474）中的评估显示，t-nanoEM在两种不同大小的捕获面板（1.5 Mb的泛癌面板和123 Mb的定制甲基化组面板）上均表现出色。特别是对于短读长难以分析的区域，如高度同源的HSP70基因家族和富含GC串联重复的MUC1基因启动子区，t-nanoEM能够清晰区分这些区域并准确检测其甲基化状态。

单倍型特异性甲基化分析

研究人员开发了专门的生物信息学流程，能够从转化后的长读长数据中准确分型 heterozygous SNPs（杂合单核苷酸多态性），并检测单倍型特异性差异甲基化区域（DMR）。他们在乳腺癌细胞系中成功鉴定了已知的印记基因区域（如PARD6G-AS1和MEST），并发现MEST基因在BT474细胞中出现了印记丢失现象。

临床应用验证：乳腺癌样本

将t-nanoEM应用于乳腺癌临床标本（BRC26），研究人员对肿瘤和正常区域进行了显微切割分析。结果显示，肿瘤特异性甲基化变化在PGR、GATA3等关键基因上得到清晰呈现。更重要的是，他们成功检测到了单倍型特异性甲基化模式的改变，包括印记基因（如MEST和NAP1L5）的丢失，以及TJP2、OXTR等基因的新发等位基因偏好性甲基化。

临床应用验证：肺癌样本

在肺癌样本（LUAD14）中，研究人员结合空间转录组数据，对5个具有不同分化程度的区域进行了t-nanoEM分析。他们发现，分化较差区域（R5）的整体甲基化水平较高，且特定基因（如HOPX、FBXO32、HSPA1A）的甲基化状态与基因表达水平密切相关。单倍型分析还揭示了ZFP36L2等印记基因的异常甲基化模式。

技术创新亮点

t-nanoEM技术的另一大优势是支持多重样本分析。研究人员成功实现了多个样本的混合捕获和测序后demultiplexing（多重拆分），大大提高了实验通量和成本效益。此外，通过结合体细胞突变信息，他们还能够特异性地分析癌细胞来源的DNA分子的甲基化状态，为肿瘤异质性研究提供了新视角。

这项研究开发的t-nanoEM技术成功解决了靶向长读长甲基化分析在临床应用中的关键瓶颈问题。与现有方法相比，t-nanoEM具有明显的技术优势：它只需要纳克级的DNA输入量，远低于Cas9富集（微克级）和自适应采样（数百纳克）的要求；能够同时分析数百个目标区域，克服了PCR方法的可扩展性限制；更重要的是，它能够提供单倍型分辨率和突变等位基因特异性的甲基化信息，这是短读长测序难以实现的。

虽然t-nanoEM在读长（约5 kb）上略逊于基于天然DNA测序的方法，且工作流程相对复杂，但其低DNA需求和高目标区域覆盖深度的特点，使其特别适合临床样本的应用。特别是在肿瘤异质性研究、印记基因异常检测以及调控突变对甲基化影响分析等方面，t-nanoEM展现出巨大潜力。

未来，随着单细胞水平酶学转化技术的发展，t-nanoEM有望进一步降低DNA需求，实现单细胞水平的长读长甲基化分析，为肿瘤生物学和临床诊断开辟新的研究途径。这项技术不仅为癌症表观遗传学研究提供了强大工具，也为其他疾病领域的DNA甲基化分析带来了新的可能性。