动态3D微流控平台探索卵巢癌靶向治疗、化疗与病毒治疗的联合递送策略

《Drug Delivery and Translational Research》：Dynamic 3D microfluidic platform for exploring combined targeted therapy, chemotherapy, and virotherapy delivery in ovarian cancer

本研究针对卵巢癌晚期诊断、易复发及标准疗法耐药等治疗难题，开发了一种动态微流控3D离体肿瘤模型，用于评估系统性多模式治疗策略。研究人员将可灌注肿瘤球体与外周血单核细胞（PBMCs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）共培养，模拟血管化肿瘤环境，通过流动循环给予溶瘤腺病毒Ad5/3-D24-ICOSL-CD40L、顺铂、紫杉醇和尼达尼布。结果表明，病毒先导方案（病毒给药48小时后再给予化疗）显著优于联合给药策略，可减小球体面积并抑制肿瘤反弹，其机制与增强病毒复制、持续免疫原性细胞死亡（ICD）及改善免疫细胞浸润相关。该肿瘤芯片平台为实时监测治疗反应、免疫激活及药物递送提供了生理相关工具，为优化卵巢癌联合治疗方案及推进个性化治疗提供了强有力的临床前系统。

卵巢癌，因其症状隐匿、诊断时常已届晚期，且易对标准疗法产生耐药，被称为“沉默的杀手”，是全球女性健康面临的重大挑战。尽管手术、放疗和铂类化疗构成了标准治疗方案，但多数晚期患者仍面临复发难题。靶向治疗如PARP抑制剂和贝伐珠单抗虽显示出临床益处，但其疗效存在异质性，耐药性的出现限制了长期成功。近年来，溶瘤病毒（Oncolytic Viruses, OVs）作为一种新兴的免疫治疗策略，因其能选择性靶向并摧毁肿瘤细胞，同时刺激免疫应答而备受关注。然而，其临床疗效常因免疫抑制性肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）和低效的病毒递送而受限。传统二维（2D）细胞培养和静态三维（3D）球体模型难以模拟体内肿瘤的复杂性，尤其是在评估涉及多种作用机制和给药途径的联合疗法时。为了克服这些障碍，迫切需要能够更真实地模拟体内条件的研究平台。

为此，由Lukasz Kuryk、Sara Mathlouthi、Mariangela Garofalo等研究人员在《Drug Delivery and Translational Research》上发表的研究，开发了一种动态的、基于微流控的三维（3D）离体肿瘤平台，旨在探索溶瘤病毒疗法、化疗和靶向治疗联合递送在卵巢癌中的效果。该研究聚焦于一种经过基因改造的溶瘤腺病毒Ad5/3-D24-ICOSL-CD40L，该病毒具有E1A区24碱基对缺失，并在E3区插入了免疫共刺激配体ICOSL和CD40L的表达盒，同时采用了Ad5/3嵌合纤维 knob 以改变趋向性。研究人员将其与一线化疗药物顺铂（Cisplatin, CIS）、紫杉醇（Paclitaxel, PTX）以及多靶点酪氨酸激酶抑制剂尼达尼布（Nintedanib, NIN）进行组合，旨在评估不同给药时序（同时给药与病毒先导）在模拟生理环境下的抗肿瘤效果。

为开展研究，作者运用了几项关键技术方法：利用人卵巢癌细胞系（A2780，子宫内膜样；OVCAR-3，高级别浆液性）建立三维肿瘤球体模型，并通过悬滴法优化球体形成用于微流控系统；构建了一套包含上下双腔室、由半透膜（10μm孔径）分隔、并配备蠕动泵实现持续灌流（流速50μL/min）的微流控平台（IVTech LiveBox2系统），该平台将肿瘤球体置于上腔室，并将来自健康供体的外周血单核细胞（PBMCs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）以特定比例（PBMCs:球体=1:5；HUVECs:PBMCs=1:5）引入下腔室进行共培养，以模拟肿瘤-免疫-血管相互作用；通过细胞毒性试验（MTS法）、流式细胞术分析病毒受体（CAR, DSG-2, CD46）表达、免疫原性细胞死亡（ICD）标志物（ATP释放、钙网蛋白Calreticulin, CRT暴露）检测、共聚焦显微镜观察病毒转导效率（使用表达mCherry的病毒变体）以及实时监测球体面积变化等多种手段，综合评价了不同治疗方案的疗效及其潜在机制。

CAR, DSG-2和CD46在卵巢癌细胞中的表达

研究首先评估了两种卵巢癌细胞系（A2780和OVCAR-3）对溶瘤腺病毒Ad5/3-D24-ICOSL-CD40L的易感性，通过检测病毒进入受体CAR、DSG-2和CD46的表达。流式细胞术分析显示，两种细胞系均高表达这三种受体，其中DSG-2的表达水平最高（平均荧光强度A2780为751，OVCAR-3为7471.5）。这表明两种卵巢癌模型都对所使用的溶瘤腺病毒具有高度的易感性，为后续病毒治疗的有效性奠定了基础。

二维卵巢癌细胞模型中细胞毒性和转导效率的评估

在二维培养模型中，研究人员比较了不同治疗方案的细胞毒性效果。他们测试了单药治疗、病毒与三药（CIS, PTX, NIN）同时给药（Co-administration）以及病毒先导48小时后再给药的方案。MTS实验结果表明，病毒先导方案在两种细胞系中均诱导了更强的细胞毒性（A2780先导方案细胞存活率18.8%，同时给药为28.3%；OVCAR-3先导方案为31.5%，同时给药为35.2%）。共聚焦显微镜观察进一步证实，病毒先导方案下，病毒（携带mCherry报告基因）的转导和复制效率更高，荧光信号更强，说明先给予病毒时间使其能够有效感染和复制，从而增强了后续化疗的杀伤效果。同时，也观察到了各单药（PTX引起有丝分裂阻滞，CIS引起核固缩，NIN抑制增殖）以及联合用药后典型的细胞形态学变化，如细胞皱缩、变圆和脱落。

免疫原性细胞死亡评估

为了探究治疗是否激发了抗肿瘤免疫应答，研究人员检测了免疫原性细胞死亡（ICD）的标志物——细胞表面钙网蛋白（CRT）暴露和细胞外ATP释放。结果显示，联合治疗，特别是病毒先导方案，显著提高了这两种ICD标志物的水平。在A2780和OVCAR-3细胞中，先导方案下的CRT暴露分别达到20%和21%，ATP释放水平分别为50%和43%。值得注意的是，溶瘤病毒本身就能诱导较强的ATP释放。这些结果表明，病毒先导方案能够更有效地触发ICD，这可能有助于激活免疫系统，增强抗肿瘤免疫应答。

三维卵巢癌模型

为了更接近体内肿瘤的复杂结构，研究建立了三维肿瘤球体模型。在静态3D模型中，多次给药并长期随访观察球体面积变化。结果显示，与单药治疗相比，联合治疗能更有效地抑制球体生长。更重要的是，病毒先导方案的效果优于同时给药方案，并且在长期观察中显示出抑制肿瘤反弹的趋势，提示先导策略可能延长治疗有效期并降低复发风险。

基于微流控的3D共培养模型用于评估卵巢癌联合疗法

本研究最核心的创新在于引入了动态微流控3D共培养模型。该模型将肿瘤球体、PBMCs和HUVECs整合在一个持续灌流的系统中，更好地模拟了体内的肿瘤微环境、系统药物暴露和免疫细胞浸润。在这个更先进的平台上，研究人员再次比较了病毒先导方案和同时给药方案。结果清晰地显示，在动态灌流条件下，病毒先导方案依然表现出显著优势。至第31天，先导方案处理的球体面积（A2780: 10,895 μm2；OVCAR-3: 16,845 μm2）远小于同时给药方案（A2780: 35,895 μm2；OVCAR-3: 29,395 μm2）和对照组。这表明在模拟生理流动的条件下，病毒先导策略能更有效地控制肿瘤生长。该平台还允许实时监测治疗反应，揭示了先导方案不仅能持续缩小肿瘤，还能减轻化疗后常见的肿瘤反弹效应。

研究结论与讨论

本研究成功开发并验证了一个动态的3D微流控平台，该平台能够模拟血管化肿瘤微环境，用于评估溶瘤腺病毒Ad5/3-D24-ICOSL-CD40L与化疗、靶向药物联合治疗卵巢癌的策略。研究结果表明，采用病毒先导（priming）策略——即在化疗前48小时给予溶瘤病毒——相较于病毒与化疗药物同时给药的方案，能产生更显著且持久的抗肿瘤效果，表现为肿瘤球体面积的显著减小和肿瘤反弹的抑制。这种增强的治疗效果与病毒复制增加、持续的免疫原性细胞死亡（ICD）以及改善的免疫细胞浸润密切相关，突出了治疗时序和肿瘤微环境预调节的重要性。

该研究的重要意义在于：首先，它证实了溶瘤病毒作为免疫激活剂，能够通过表达ICOSL和CD40L等共刺激分子，改变免疫抑制性的肿瘤微环境，为后续化疗创造更有利的条件。其次，所开发的微流控“肿瘤芯片”平台克服了传统静态模型的局限性，通过整合流体动力学、免疫细胞和血管成分，提供了一个更生理相关、更具预测价值的临床前工具，用于优化复杂的联合治疗方案。这为在进入成本高昂的临床试验之前，更准确地评估药物相互作用、疗效和潜在毒性奠定了基础。最后，研究强调了治疗顺序在 multimodal therapy（多模式治疗）中的关键作用，为卵巢癌，特别是耐药或复发性卵巢癌的患者，提供了一种有前景的个性化治疗新策略。未来，将该平台与纳米药物递送系统等先进技术结合，有望进一步改善药物的靶向递送和肿瘤内滞留，从而提升治疗效果。