基于棕榈酰化分子特征的COX6A1调控代谢相关脂肪肝病机制研究

《Journal of Translational Medicine》：A novel palmitoylation-based molecular signature reveals COX6A1 as a key regulator in metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease

本刊推荐：为解决代谢相关脂肪肝病（MASLD）中棕榈酰化修饰、线粒体功能与免疫重塑的分子联系不明这一关键问题，研究人员通过整合多组学数据与机器学习方法，发现COX6A1作为关键调控因子，通过影响线粒体氧化应激和免疫信号通路成为潜在治疗靶点，为MASLD的精准分型与靶向治疗提供了新思路。

随着全球肥胖和代谢综合征患病率的持续攀升，代谢相关脂肪肝病（MASLD）已成为最常见的慢性肝病之一，影响着全球约32.4%的人口。这种疾病谱系从单纯的肝脏脂肪变性（MASL）可进展为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH），最终导致肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌（HCC）。尽管其临床意义重大，但MASLD的发病机制复杂，涉及脂质代谢紊乱、氧化应激、炎症反应和肝细胞凋亡等多种病理过程，其中棕榈酰化修饰（palmitoylation）作为重要的蛋白质翻译后修饰，在调节蛋白质定位、稳定性和功能方面的作用尚未在MASLD中得到系统阐释。

棕榈酰化是通过棕榈酰基转移酶（ZDHHC家族）将棕榈酸共价连接到半胱氨酸残基的可逆过程，参与调控多种信号通路。近年研究发现，棕榈酰化修饰在癌症、免疫疾病和神经退行性疾病中发挥关键作用，但其在MASLD特别是免疫微环境重塑中的功能仍不清楚。正是基于这一研究空白，余天琪团队开展了本次研究，旨在揭示棕榈酰化相关基因（PRGs）在MASLD分子分型中的核心作用，并识别关键调控靶点。

研究人员整合了四个GEO批量RNA测序数据集（GSE126848、GSE130970、GSE135251、GSE213621）和一个单细胞RNA测序数据集（GSE136103），通过共识聚类分析将MASLD患者分为两个分子亚型：富含代谢通路的Cluster 1和显示免疫激活特征的Cluster 2。利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）和包含12种机器学习算法的综合筛选流程，研究人员鉴定出COX6A1、COX7A2和NDUFA4等关键基因，其中COX6A1（细胞色素c氧化酶亚基6A1）表现出最强的诊断价值（AUC>0.75）。

在实验验证阶段，研究团队通过小干扰RNA（siRNA）敲低HepG2细胞中的COX6A1表达，发现能够显著减轻棕榈酸（PA）诱导的脂质积累、线粒体膜电位（ΔΨm）下降和活性氧（ROS）产生。进一步机制研究表明，COX6A1敲低通过抑制p53信号通路和线粒体凋亡途径，降低了肝细胞凋亡率，提示其在MASLD进展中的核心调控作用。

本研究采用的主要技术方法包括：多队列转录组数据整合与批次校正（ComBat算法）、共识聚类分析（ConsensusClusterPlus）、差异表达分析（limma包）、功能富集分析（clusterProfiler）、加权基因共表达网络构建（WGCNA）、机器学习模型构建与验证（12种算法组合）、免疫细胞浸润评估（六种算法）、单细胞RNA测序分析（Seurat和CellChat流程），以及体外细胞模型（siRNA转染、流式细胞术、Western blot等）和动物模型（MCD和HFD饮食诱导）验证。

分子和功能异质性分析显示MASLD存在棕榈酰化相关亚型

通过共识聚类分析，研究发现MASLD样本可划分为两个具有显著差异的分子亚型。Cluster 1主要富集于代谢调节相关通路，包括组蛋白修饰、离子通道活性和染色质重塑等生物过程；而Cluster 2则表现出明显的免疫激活特征，涉及抗原呈递、MHC II类复合物组装和天然免疫应答等通路。这种分型反映了MASLD疾病的异质性，为后续精准治疗策略的开发提供了理论基础。

关键基因筛选鉴定COX6A1等诊断标志物

通过WGCNA和机器学习算法的联合应用，研究团队从13个候选基因中筛选出COX6A1、COX7A2和NDUFA4三个核心基因。这些基因不仅在训练集（GSE213621）中表现出优异的诊断性能（AUC>0.75），在三个独立验证集中也保持稳定表现。决策曲线分析（DCA）进一步证实了基于这些基因构建的列线图模型在临床应用中具有显著的净获益。

免疫微环境特征揭示亚型特异性免疫景观

免疫浸润分析显示，Cluster 2亚型中多种免疫细胞（包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞等）的浸润水平显著升高，且免疫检查点分子（如CD274/PD-L1、CD276/B7-H3）表达上调。相反，Cluster 1则呈现相对"免疫静默"状态。值得注意的是，COX6A1等关键基因与免疫功能评分呈负相关，提示代谢活跃的肝细胞可能通过特定机制抑制免疫应答。

单细胞转录组解析细胞间通讯网络

单细胞RNA测序分析揭示了肝脏微环境中11种细胞类型的组成和分布特征。研究发现COX6A1主要表达于肝细胞、巨噬细胞和内皮细胞中，且在MASLD样本中显著上调。细胞通讯分析表明，COX6A1阳性肝细胞在疾病状态下与免疫细胞（特别是巨噬细胞和T细胞）的相互作用显著增强，主要通过MIF和TNF信号通路介导。

动物模型验证关键基因表达

在高脂饮食（HFD）和蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）饮食诱导的小鼠MASLD模型中，肝脏组织病理学分析证实了肝脂肪变性、炎症和纤维化的典型特征。免疫组化和Western blot结果一致显示COX6A1和NDUFA4在疾病组肝脏组织中表达显著上调，与生物信息学分析结果相互印证。

COX6A1功能机制解析

体外实验表明，COX6A1敲低能够显著减轻棕榈酸诱导的肝细胞脂质积累和线粒体功能障碍。机制上，COX6A1缺失通过降低线粒体ROS产生、维持线粒体膜电位稳定，进而抑制p53介导的凋亡通路。Western blot分析显示，COX6A1敲低后，促凋亡蛋白BAX、Caspase-9和Caspase-3表达下降，而抗凋亡蛋白BCL2表达上升。

本研究通过多组学整合分析系统揭示了棕榈酰化修饰在MASLD分子分型中的核心作用，首次提出基于棕榈酰化相关基因的MASLD亚型分类框架。研究发现COX6A1作为线粒体呼吸链复合物IV的关键亚基，在MASLD发病机制中扮演双重角色：一方面通过调节线粒体能量代谢影响肝细胞脂质稳态，另一方面通过修饰免疫微环境沟通网络参与疾病进展。实验验证表明，靶向COX6A1能够显著改善肝细胞脂毒性损伤，这为开发针对MASLD特定亚型的精准治疗策略提供了新靶点。

该研究的创新性在于将蛋白质翻译后修饰景观与代谢-免疫轴调控网络相结合，揭示了MASLD异质性的分子基础。不仅为理解MASLD发病机制提供了新视角，也为临床诊断生物标志物的开发和靶向治疗策略的设计奠定了重要基础。未来研究可进一步探索棕榈酰化动态修饰在MASLD不同阶段的调控机制，以及COX6A1作为治疗靶点的转化应用前景。