综述：人类临床前多发性骨髓瘤体外模型在疾病建模和疗法筛选中的应用

《Journal of Biological Engineering》：Human preclinical multiple myeloma in vitro models for disease modeling and therapy screening

本综述系统分析了多发性骨髓瘤（MM）体外模型的演进历程，从传统悬浮培养到当前3D组织工程平台。文章重点探讨了三维（3D）培养系统（如类器官、支架模型、生物打印和器官芯片）在模拟骨髓微环境（BMM）方面的优势与局限，特别强调了构建具备免疫活性、血管化和患者特异性的人类化平台对于精准预测治疗反应及克服耐药性的重要性。作者指出，整合计算模型与高通量药物筛选将加速MM个体化治疗的发展。

引言

多发性骨髓瘤（MM）是一种血液恶性肿瘤，其特征是恶性浆细胞在骨髓微环境（BMM）中不受控制地扩增。尽管MM细胞系的悬浮培养和小鼠模型一直是研究MM发病机制的基石，但这些传统系统无法再现人类肿瘤微环境（TME）的关键方面。当前模型在解决关键生物学问题方面存在不足，包括获得性耐药机制、免疫逃逸策略以及细胞间通讯在疾病进展中的作用。这些局限性源于缺乏生理相关的细胞外基质（ECM）结构、原代人类基质和免疫细胞群，以及无法模拟具有功能性血管系统的骨髓生态位。

三维（3D）培养平台通过整合结构复杂性和细胞异质性来弥补这些缺陷。然而，许多现有的3D模型对于全面的MM建模仍然不足，因为它们通常缺乏集成的人类源性基质区室、功能性免疫监视机制以及共同调节MM病理生物学的生理血管网络。需要先进的人类化体外模型——特别是那些在免疫活性微环境中整合患者来源细胞的模型——来弥合临床前发现与临床结果之间的转化鸿沟。

悬浮细胞培养模型

MM研究中的悬浮模型（图2）尽管有其局限性，但在药物开发中继续发挥着重要作用。这些模型主要利用在悬浮状态下培养的人类骨髓瘤细胞系，具有成本低、高通量筛选能力强、标准化和可重复性等优点。然而，这些传统细胞系在多大程度上能模拟患者样本一直是一个长期存在的问题。

为了弥补其中一些局限性，研究人员开发了更先进的模型。例如，建立了Transwell共培养系统来研究多种细胞类型之间的相互作用。在这种模型中，人BM基质HS-5细胞培养在基底室，而MM RPMI-8226细胞放置在顶室。这种设置允许在更复杂的环境中研究旁分泌信号传导和药物效应。虽然这些模型为药物建模和临床前筛选的早期研究铺平了道路，但悬浮模型从根本上受到限制，无法复制MM微环境的关键方面，例如氧气和营养梯度、细胞-细胞和细胞-基质相互作用以及3D BM结构。因此，虽然悬浮模型对于初步药物筛选和基本机制研究仍然有用，但人们越来越认识到它们的局限性，并转向能更好地再现MM体内条件的共培养3D模型。

3D MM培养系统

用于开发MM 3D模型的组织工程技术为高级研究和创新治疗探索提供了强大的平台。通过捕捉传统单层培养系统通常未考虑的MM生态位内独特的细胞和空间相互作用，3D组织工程模型提供了更全面的疾病表征，但未来的研究人员仍需解决许多局限性。在本节综述中，我们将讨论当前已开发的3D共培养模型及其局限性。

3D球体/类器官模型

球体/类器官模型（图2）已成为癌症研究中的变革性工具，能够监测细胞-细胞和细胞-基质的相互作用。球体通过细胞在悬浮液中自发聚集形成，促进了这些细胞-细胞相互作用，并允许细胞分泌自己的细胞外基质（ECM）。这种自我生成的ECM不仅提供结构支持，还增强了模型的生理准确性。

然而，使用3D细胞球体/类器官模型研究MM存在显著的局限性。一个显著的缺点是在这些模型中缺乏血管网络和血管周围生态位的整合。这种血管化的缺乏限制了这些模型复制体内生理过程维持的营养浓度平衡的能力，而这正是模拟TME所必需的。此外，骨髓瘤细胞与骨内膜骨衬里之间的相互作用——骨髓瘤生物学的一个关键因素——在先前使用3D细胞球体模型的研究中很大程度上被忽视了。骨内膜生态位创造了一个特殊的微环境，包括粘附、迁移和耐药性发展等过程。没有这些元素，简化的3D球体模型就无法捕捉TME的复杂性，限制了它们在全面理解骨髓瘤发病机制方面的效用。

3D支架模型

三维支架模型（图2）代表了一种流行且有价值的研究MM的方法，与传统的悬浮培养和3D球体相比，提供了更生理相关的细胞-基质相互作用、ECM组成和机械性能。多种动物来源的水凝胶已被用于形成支架以支持MM细胞存活、增殖或基质相互作用。

除了Huang等人，Khan等人如前所述，也在他们的类器官模型中使用了GelMA来模拟BM血管周围生态位，实现了高MM细胞活力和植入。使用另一种水凝胶，Narayanan等人开发了一个3D HA基模型系统，证明中等硬度的水凝胶比低或高硬度的水凝胶或基于Matrigel的培养物支持更高的骨髓瘤细胞存活和增殖。这些模型共同代表了在开发用于治疗筛选的患者来源平台方面取得的进展，为个性化多发性骨髓瘤治疗提供了机会。需要强调的是，这些模型中的许多缺乏人类免疫景观，这限制了它们完全捕捉天然BMM中药物反应和抵抗的免疫介导机制的能力。

3D生物打印模型

生物打印是3D打印的一种特殊形式（图2），可以精确沉积和组装生物相关材料——例如细胞、生长因子和生物材料——在特定位置，以创建用于医学和研究应用的类组织或类器官结构。其在开发MM模型中的一个关键优势是能够构建具有不同区域的结构，并在单个模型中整合多种细胞类型，有效重现MM微环境的细胞和空间相互作用。

生物打印技术自20世纪80年代发展以来已取得巨大进步，并成为构建3D体外组织工程培养系统的关键资产。上述这些生物打印的MM模型在解决诸如血管化和空间组织等局限性方面表现出色，但未来的模型需要整合更广泛的免疫细胞以更好地理解MM TME。

动态骨髓建模

BMM的某些特征，例如营养循环、废物清除和剪切力，无法在静态培养系统中复制。为了解决这个问题，Belloni等人在2013年开创了生物反应器技术的使用，调整旋转细胞培养系统（RCCS）（图2）来培养原代骨髓瘤细胞。

RCCS生物反应器的一个独特特征是，通过将细胞维持在自由落体状态来部分模拟机械应力，这减少了剪切应力并改善了与静态培养相比的营养和废物交换。然而，RCCS可能无法完全复制体内存在的复杂机械力，例如在正常生理活动期间骨组织所经历的精确剪切应力、压缩力和循环负荷。

基于器官芯片的MM模型

器官芯片（图2）是精心设计的微流体设备，包含循环和细胞分区以支持独特的组织功能。特别是，微流体器官芯片能够创建仿生结构，在受控生理环境中复制生物过程。

近年来，为了弥补器官芯片设备的一个常见局限性，Goshal等人通过引入一个血管化的芯片设备开创了该领域。该系统通过在人模块化微流体设备中整合人MSC、成骨细胞、内皮细胞、周细胞和其他基质成分，重现了骨内膜和血管周围BM生态位。此外，该系统允许灌注供体匹配的CAR T细胞，从而能够在生理相关的微环境中实时评估T细胞迁移、存活、分化和对MM细胞的细胞毒性。这些模型共同在研究肿瘤-免疫相互作用方面取得了巨大进步，然而，它们仅与有限的免疫细胞共培养，因此无法定义系统中造血作用的作用及其对疾病建模和治疗筛选的影响。因此，需要整合广泛的免疫细胞以准确描述BMM。

当前挑战与未来方向

虽然本综述中的所有模型都为药物测试和临床前患者样本测试奠定了基础，但没有一个所述模型是完全人类化的，并且缺乏其他模型可能具有的组件。首先，MM高度依赖于其微环境，包括基质细胞、内皮细胞、免疫细胞和细胞外因子，这些在疾病进展、免疫逃逸、耐药性和治疗失败中起着关键作用。传统的悬浮系统无法捕捉这些相互作用的全部，并且许多当前的3D细胞培养系统缺乏免疫环境，限制了它们在研究MM生物学、药物测试或预测治疗反应方面的效用。为了推动该领域发展，必须共同应对这些挑战，并且我们应努力开发能够更真实地再现天然TME复杂性的模型。

免疫活性组件

鉴于免疫系统在MM进展和治疗反应中的关键作用，开发包含功能性免疫组分的免疫活性体外模型至关重要，并且在某些情况下可以协同提高药物治疗效果。此类模型应旨在更准确地复制BMM内的复杂相互作用，涉及充分代表T细胞（用于双特异性抗体测试）、NK细胞和巨噬细胞（用于促进肿瘤-免疫串扰的单克隆抗体），这些在传统培养系统中 largely 缺失。

虽然上述大多数模型整合了基质细胞和内皮细胞的某些方面以及一些免疫亚群（如巨噬细胞或T淋巴细胞），但它们通常缺乏造血干细胞和祖细胞（HSPC）或造血生态位的其他重要组成部分，因此无法捕捉在生理相关系统中相互作用的广泛免疫细胞。将HSPC整合到培养系统中，3D组织工程模型可以为MM如何破坏正常造血过程或劫持生态位信号以供自身存活提供新的见解。未来MM建模的另一个令人兴奋的方向可能是将生发中心（GC）样系统与工程组织生态位整合，以研究特定的遗传病变如何驱动从意义未明的单克隆丙种球蛋白病（MGUS）向多发性骨髓瘤的转变。

血管化

另一个主要限制是大多数3D BM模型中缺乏血管化。BM是一个高度血管化的组织，血管提供氧气、营养物质和信号分子，这些对正常造血和肿瘤生长都至关重要。当前模型中血管网络的缺失限制了它们复制对MM进展至关重要的血管生成或血管周围生态位相互作用的能力。开发血管化模型可以通过使研究人员能够研究血管生成如何促进肿瘤生长或抗血管生成疗法如何影响MM进展来解决这一局限性。

细胞外信号

ECM在支持肿瘤生长和调节BM生态位中的细胞行为方面起着关键作用。尽管许多水凝胶已成功用于创建MM模型，但它们可能无法完全复制体内观察到的动态重塑。整合患者来源的ECM或使用可调生物材料来调整硬度将更好地模拟BM生态位的生理和机械特性，因为研究发现中等硬度的水凝胶支持更高的骨髓瘤细胞存活和增殖。这也将允许研究人员研究ECM重塑如何促进耐药性，或整合素介导的粘附如何影响MM细胞存活。

细胞来源

细胞来源的选择和多样性对于在BM内模拟MM至关重要，因为疾病的进展、耐药性和存活受到MM细胞与各种BM驻留细胞之间相互作用的严格调控。将相关细胞成分（如MSC、成骨细胞、内皮细胞和免疫细胞）整合到3D培养系统或器官芯片平台中，使这些模型能够更真实地重现天然BMM中发生的促存活信号、细胞-细胞接触和可溶性因子交换。

将患者样本整合到3D共培养系统中的能力是设计临床前测试设备的关键。筛选平台的开发代表了个体化治疗方法的范式转变，使用高通量液体处理系统和自动化成像平台——所有这些都可以在患者来源的3D共培养系统的设计中实施。通过开发测试组合疗法的模型，可以发现药物组合的协同作用，为未来的治疗方案提供临床指导。

计算建模与系统分析

多年来，已经开发了数学模型来模拟肿瘤生长并研究肿瘤动力学对治疗和耐药性的反应。尽管有其前景，但EMMA对药物组合的预测假设了通过独立模拟每种药物的反应而产生的加性效应——这种简化忽略了协同或拮抗相互作用。需要解决当前计算模型的一个总体局限性是使预测个性化。

标准化

标准化问题对3D BM模型在研究或临床环境中的广泛采用构成了挑战。培养方法、支架材料、细胞来源和读出技术的可变性可能导致研究结果不一致，使得比较发现或验证治疗靶点变得困难。建立用于创建和使用3D BM模型的标准化方案对于确保可重复性并促进其整合到药物开发管道中至关重要。将计算建模和计算机模拟与实验性3D系统结合可能会进一步增强治疗反应和疾病进展的预测能力。总之，标准化3D共培养系统也将促进制药行业快速采用这些模型，以便在药物开发期间更精确地预测治疗疗效和耐药机制。

讨论

虽然传统的独立悬浮细胞培养模型以及动物模型作为初步药物筛选和机制研究的基石，但它们在准确代表BMM方面的局限性 necessitates 使用更先进的系统。正如相当大比例的患者对标准方案无反应以及几乎所有患者最终都会产生耐药性所证明的那样，药物开发中传统的“一刀切”方法已经达到了其极限。多发性骨髓瘤治疗的未来不仅在于发现新的靶点，还在于根据个体患者特征精确匹配现有和新兴疗法，基于机制协同作用优化组合策略，并在临床出现耐药模式之前进行预测——所有这些都要求更复杂、生理相关的建模平台，能够重现骨髓微环境的复杂、患者特异性生物学。