绿豆VrPR1基因家族功能解析：CAPE1结构域介导的抗腐霉病新机制

《BMC Genomics》：Functional evaluation of pathogenesis-related protein-1 (PR1) genes in mung bean (Vigna radiata) response to Pythium myriotylum

本研究针对绿豆根腐病病原体Pythium myriotylum的防治难题，通过生物信息学筛选出6个VrPR1基因家族成员，发现VrPR1-3/4/6能显著增强植物抗病性。关键发现表明VrPR1-6的C末端CAPE1结构域是其抗病功能的核心，转录组分析进一步揭示该过程涉及Ca2+信号通路调控。该研究为豆科作物抗病育种提供了新靶点，发表于《BMC Genomics》2025年第26卷。

绿豆作为亚洲重要的经济作物，在生长过程中常遭受根腐病的严重威胁，其中Pythium myriotylum Drechsler是主要致病菌之一。受感染植株表现为生长迟缓、叶片黄化萎蔫，根部出现水浸状变色直至腐烂，严重时可导致幼苗死亡，对产量和品质造成双重打击。虽然化学防治能暂时控制病情，但长期使用易导致病原菌抗药性和环境污染问题。因此，挖掘抗病基因、解析植物免疫机制成为可持续防控的关键。

植物在长期进化中形成了复杂的免疫系统，其中病原相关蛋白（Pathogenesis-Related proteins, PR）是防御机制的重要组成。PR1作为首个被发现的PR蛋白家族成员，在植物抵御病原侵染过程中发挥核心作用。然而，PR1在绿豆抵抗P. myriotylum中的具体功能尚不明确。此外，PR1蛋白C末端的CAP衍生肽（CAP-derived peptide 1, CAPE1）在多种植物中被证实可作为防御信号激活免疫反应，但在绿豆中尚未被表征。

为解决上述问题，周艳艳等人在《BMC Genomics》发表了题为"Functional evaluation of pathogenesis-related protein-1(PR1) genes in mung bean(Vigna radiata) response to Pythium myriotylum"的研究。该工作通过生物信息学分析在绿豆基因组中鉴定到6个含保守CAPE1结构域（PxGNxxxxxPY）的VrPR1基因家族成员，并发现VrPR1-3、VrPR1-4和VrPR1-6在病原侵染后表达显著上调。通过本氏烟瞬时表达系统和绿豆毛根转化系统证实这三个基因能增强对P. myriotylum的抗性，其中VrPR1-6效果最为显著。进一步机制研究表明VrPR1-6的抗病功能依赖于其C末端CAPE1结构域，转录组分析提示该过程可能通过调控Ca²⁺信号通路实现。

研究主要采用基因组学分析、分子生物学技术和病理学实验相结合的方法。关键技术包括：基于绿豆基因组（GCA_000741045.2）的VrPR1基因家族鉴定与进化分析；qRT-PCR检测基因表达模式；亚细胞定位观察蛋白分布；农杆菌介导的本氏烟瞬时过表达和绿豆毛根转化进行功能验证；Western blot检测蛋白表达；RNA-seq分析差异表达基因；以及GO和KEGG富集分析揭示信号通路。所有植物材料均来自江苏省农业科学院经济作物研究所。

VrPR1基因家族的鉴定与进化分析

研究人员通过BLASTP和HMMER搜索从绿豆基因组中鉴定出6个VrPR1基因，命名为VrPR1-1至VrPR1-6。这些基因编码的蛋白质长度为157-200个氨基酸，预测分子量为17.96-23.23 kDa，等电点介于6.12-7.39之间，均含有分泌信号肽和CAPE1结构域。系统进化分析显示VrPR1与豇豆（Vigna unguiculata）PR1亲缘关系更近。染色体定位发现VrPR1基因主要集中在Chr7、Chr8和Chr10上，其中Chr7含有4个基因。启动子顺式作用元件分析表明VrPR1-2、VrPR1-5和VrPR1-6含有茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）响应元件，qRT-PCR结果证实这些基因确实能被这两种激素诱导表达。

VrPR1表达模式分析

组织特异性表达显示VrPR1-1和VrPR1-6在根中高表达，而VrPR1-2、VrPR1-3、VrPR1-4和VrPR1-5在茎中表达较高。在成熟植株中，不同器官表达模式各异：VrPR1-1主要在幼荚中表达，VrPR1-2和VrPR1-5在花中高表达，VrPR1-3和VrPR1-6在幼种子中表达较高，VrPR1-4在根、茎、幼叶和花中均有较高表达。病原诱导实验发现P. myriotylum侵染能显著上调所有VrPR1基因表达，其中VrPR1-3、VrPR1-4和VrPR1-6在72小时表达量分别达到对照的80倍、39倍和76倍，因此选择这三个基因进行后续功能研究。

VrPR1蛋白的亚细胞定位

通过农杆菌浸润法在本氏烟叶片中表达VrPR1-GFP融合蛋白，激光共聚焦显微镜观察发现VrPR1-3、VrPR1-4和VrPR1-6均定位于细胞外空间，与生物信息学预测的胞外定位一致，表明这些蛋白可能通过分泌到胞外发挥防御功能。

VrPR1增强本氏烟对P. myriotylum的抗性

Western blot验证蛋白表达后，病原接种实验显示过表达VrPR1-3、VrPR1-4和VrPR1-6的本氏烟叶片病斑直径显著小于GFP对照。台盼蓝染色发现转基因叶片周围菌丝生长更少，病原生物量检测表明VrPR1-6、VrPR1-3和VrPR1-4分别使病原生物量降低80%、67%和52%，其中VrPR1-6抗病效果最强。

VrPR1增强绿豆对P. myriotylum的抗性

通过发根农杆菌K599介导的毛根转化获得过表达VrPR1的绿豆毛根，接种实验发现转基因毛根病斑长度显著减小。病原生物量检测显示VrPR1-6使病原生物量降低80%，卵孢子数量减少45%；VrPR1-3和VrPR1-4也分别使病原生物量降低68%和71%，卵孢子减少43%和42%，进一步验证了VrPR1的正向抗病功能。

VrPR1-6抗病性依赖CAPE1结构域

为探究CAPE1结构域的功能，研究人员构建了C末端缺失突变体VrPR1-6ΔCAPE1。接种实验发现缺失突变体丧失抗病能力，病斑直径和病原生物量与对照无显著差异，菌丝扩展也无明显抑制，证明CAPE1结构域是VrPR1-6发挥抗病功能的关键区域。

VrPR1-6过表达调控Ca²⁺信号通路

转录组分析发现，在未接种条件下，VrPR1-6过表达毛根有3187个差异表达基因（1633个上调，1554个下调）；接种后差异基因数为2209个（1725个上调，484个下调）。KEGG富集分析显示"植物-病原互作"通路显著富集，其中10个Ca²⁺信号通路相关基因（包括钙调蛋白CaM、类钙调蛋白CAMLs、钙依赖蛋白激酶CDPKs、环核苷酸门控通道CNGCs和呼吸爆发氧化酶同源物Rboh）表达上调，提示VrPR1-6可能通过调控Ca²⁺信号通路增强抗病性。

本研究首次在绿豆中系统鉴定了VrPR1基因家族，证实VrPR1-3、VrPR1-4和VrPR1-6通过分泌到胞外增强对P. myriotylum的抗性，其中VrPR1-6的功效最为显著。机制上，VrPR1-6的抗病功能依赖于其C末端CAPE1结构域，并可能通过激活Ca²⁺信号通路实现。这些发现不仅深化了对PR1蛋白在豆科作物抗病中作用机制的理解，为绿豆抗病育种提供了重要基因资源，也为研究植物与卵菌互作的分子机制提供了新视角。该研究建立的绿豆毛根转化系统为豆科植物基因功能研究提供了有效技术平台，对legume作物抗病改良具有重要参考价值。