基于ceRNA网络、单细胞测序与AlphaFold 2探索深静脉血栓形成的分子复杂性

《BMC Medical Genomics》：The molecular complexity of deep vein thrombosis was preliminarily explored based on the ceRNA network, scRNA-seq and AlphaFold 2

本研究针对深静脉血栓形成(DVT)病理机制复杂、调控靶点不明的问题，通过全转录组测序构建ceRNA调控网络，结合单细胞RNA测序(scRNA-seq)和AlphaFold 2蛋白质结构预测技术，发现JAK2、CD36、TNFSF13B、TLR7和PARP9等关键基因，并揭示hsa_circ_0095124/hsa-miR-3074-5p/TNFSF13B通路在DVT中的潜在调控作用，为DVT的精准诊断和治疗提供新靶点。

在血管疾病领域，深静脉血栓形成（Deep Vein Thrombosis, DVT）就像一颗潜伏的"定时炸弹"——作为常见的外周血管疾病，它不仅会导致肢体疼痛、肿胀等急性症状，更可怕的是30-50%的患者在发病两年内会出现血栓后综合征（Post-thrombotic Syndrome, PTS）这一慢性并发症。目前临床诊断主要依赖D-二聚体检测，但该方法易受感染、手术、肿瘤等多种因素干扰，特异性较低。更关键的是，科学家们对DVT复杂的病理生理过程仍知之甚少，特别是不同细胞群体中炎症、凝血和纤维化通路的调控机制仍不明确。

面对这一困境，Pan等人在《BMC Medical Genomics》上发表的研究开启了一场多组学联动的探索之旅。研究人员独辟蹊径地将目光投向了占人类RNA绝大部分的非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）世界，试图揭示DVT背后的分子调控网络。

为了解开DVT的分子谜题，研究团队设计了一套多组学整合分析方案。他们首先收集了4例DVT患者和6例健康对照的外周血样本进行全转录组测序，同时另设14例样本作为外部验证集。通过生物信息学分析筛选差异表达的环状RNA（circRNA）、微RNA（miRNA）和信使RNA（mRNA），并构建ceRNA竞争性内源RNA（competing endogenous RNA）网络。此外，还利用7种蛋白相互作用网络（Protein-Protein Interaction, PPI）算法进行拓扑分析，结合AlphaFold 2预测关键蛋白的三维结构，并通过比较毒理学基因组数据库（Comparative Toxicogenomics Database, CTD）评估基因与疾病的关联性。最后，对3例DVT患者和3例健康对照的血样进行单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），以确定基因表达的细胞定位和核心通路的作用。

全转录组测序结果概览

研究团队通过DNBSEQ平台对10个样本进行检测，平均每个样本获得11.33G数据。分析共鉴定出406个差异circRNA（90个上调，316个下调）、29个差异miRNA（3个上调，26个下调）和154个差异mRNA（85个上调，69个下调）。聚类热图显示DVT患者与健康对照之间的差异表达基因具有明显区分度。GO富集分析表明，差异mRNA主要富集在细胞内受体信号通路、模式识别受体信号通路等生物过程，而KEGG分析提示血小板活化通路是DVT中最显著的生物学通路之一。

DVT相关ceRNA网络的构建与分析

研究人员通过交叉分析筛选出6个circRNA、5个miRNA和16个mRNA，构建了ceRNA调控网络。有趣的是，节点mRNA在GO和KEGG分析中同样富集于血小板活化通路，与前期差异基因分析结果高度一致。外部验证集进一步证实了GLRX、RTN3、ST3GAL6、TNFSF13B、RBFOX2和GPBAR1的表达差异，验证了ceRNA网络的可靠性。

PPI多网络算法识别枢纽基因

利用STRING数据库和Cytoscape构建PPI网络后，研究人员应用7种网络算法（包括紧密度、度值、EPC、MCC、MNC、径向性和压力）进行拓扑分析，最终筛选出5个枢纽基因：JAK2、CD36、TNFSF13B、TLR7和PARP9。这些基因在相互作用网络中处于核心地位，为后续功能研究提供了重要靶点。

DVT核心蛋白的结构构建与功能分析

研究团队运用AlphaFold 2技术对5个枢纽蛋白进行三维结构预测。pLDDT（预测局部距离差异测试）评分显示JAK2和CD36的结构预测置信度较高，而TLR7、TNFSF13B和PARP9的局部区域置信度相对较低。CTD干扰评分分析表明，CD36和JAK2与动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）、心血管疾病、肺栓塞（Pulmonary Embolism, PE）、血栓形成和血管疾病等多种DVT相关疾病具有显著关联。

scRNA-seq分析确定细胞定位

通过对25,547个细胞进行单细胞测序，研究人员成功鉴定出7种细胞类型：中性粒细胞、自然杀伤细胞（Natural Killer Cell, NK细胞）、T细胞、B细胞、肥大细胞、M1样巨噬细胞和M2样巨噬细胞。观测/预期比值（Observed/expected ratio, Ro/e）分析显示，DVT患者中T细胞、B细胞和肥大细胞处于耗竭状态，而中性粒细胞显著上调。枢纽基因表达模式分析发现，JAK2、CD36、TNFSF13B和PARP9在DVT中显著上调，其中JAK2主要分布在巨噬细胞和肥大细胞中，CD36几乎特异性表达于M2样巨噬细胞，TNFSF13B则主要在中性粒细胞和巨噬细胞中表达。

细胞间通讯分析识别信号通路

基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）显示，枢纽基因主要富集于T细胞受体信号通路、Th1和Th2细胞分化以及Th17细胞分化等通路。CellChat分析发现巨噬细胞、T细胞和B细胞间的通讯异常活跃，表明DVT早期存在明显的外周血免疫反应。特别值得注意的是，TNFSF13B/TNFRSF13C在不同类型巨噬细胞与B细胞的通讯中扮演重要角色，而CCL、CD40、GALECTIN和MIF等信号网络是T细胞、B细胞和巨噬细胞共有的信号通路。

该研究通过多组学整合分析，首次构建了DVT的ceRNA调控网络，发现hsa_circ_0095124/hsa-miR-3074-5p/TNFSF13B可能是DVT潜在的核心调控通路。单细胞水平的研究揭示了DVT过程中免疫细胞的动态变化和空间分布特征，为理解疾病发生机制提供了"细胞-分子"层面的分辨率。值得注意的是，尽管TNFSF13B在多种分析模型中均处于核心位置，但其在CTD中与DVT相关疾病的干扰评分并不显著，提示其可能通过独特机制参与DVT病理过程。

这项研究的创新之处在于将ceRNA网络、单细胞测序和蛋白质结构预测等前沿技术有机结合，为DVT研究提供了新的视角和方法学范式。然而，作者也指出研究的局限性，如样本量较小、缺乏临床预后数据的验证以及尚未进行体外实验验证靶点准确性等。未来需要多中心、大样本的序列数据来全面阐明DVT相关的细微基因组改变，为临床诊断和治疗提供更可靠的依据。

随着AlphaFold 3等新技术的不断发展，未来对TNFSF13B等关键蛋白与其受体相互作用界面的精准预测，将有望指导免疫调节疗法的开发，为DVT的精准治疗开辟新的道路。同时，单细胞测序与多组学数据的整合，将帮助我们在不同细胞类型中识别和筛选特异性基因，显著提升对DVT诊断、治疗和预后的认识水平，推动基础研究向临床应用的转化。