在单细胞水平上解析寡聚原花青素的双重骨保护机制：NR4A1介导的PTGS2抑制作用及β-连环蛋白-Runx2的激活作用

《Frontiers in Immunology》：Deciphering oligomeric proanthocyanidins’ dual osteoprotective mechanisms at single-cell resolution: NR4A1-mediated PTGS2 suppression and β-catenin-Runx2 activation

本研究通过单细胞RNA测序和网络药理学，揭示了 oligomeric proanthocyanidin（OPC）治疗骨质疏松症（OP）的双重分子机制：抑制NR4A1调控的PTGS2表达，同时激活β-catenin依赖的NR4A1-RUNX2信号轴，靶向调控C2 NR4A1+间充质干细胞（MSCs）分化，促进骨形成并抑制骨吸收。动物实验证实OPC可显著改善骨微结构参数和骨代谢标志物，为OP治疗提供了“靶向细胞亚型-多通路协同”新范式。

本研究围绕骨质疏松症（Osteoporosis, OP）这一常见的系统性骨代谢疾病展开，探讨了天然产物寡聚原花青素（Oligomeric Proanthocyanidin, OPC）在OP治疗中的作用机制。OP是一种以骨质量下降、骨微结构破坏和骨脆性增加为特征的疾病，其病理过程涉及复杂的细胞和分子调控网络。随着全球人口老龄化加剧，OP的患病率持续上升，严重影响人类健康，同时也带来了巨大的社会经济负担。当前，OP的治疗主要依赖于抗骨吸收和促骨形成两类药物，但这些传统药物在临床应用中仍面临诸多挑战，包括治疗安全性不足、疗效有限以及难以实现精准靶向治疗等。因此，寻找新的治疗策略和潜在的分子靶点显得尤为重要。

OPC作为一种广泛存在于植物中的天然多酚类化合物，具有显著的抗氧化、抗炎、抗肿瘤和抗衰老等生物活性，已被开发为营养补充剂并应用于多种健康领域。研究表明，OPC在预防和治疗OP方面展现出良好的潜力，特别是在抑制骨量流失和调节骨代谢方面具有独特优势。然而，其具体作用机制尚未完全阐明。本研究结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、网络药理学、细胞实验和动物模型等多种方法，系统地揭示了OPC在OP治疗中的双机制作用模式，为OP治疗策略的创新提供了重要的理论基础和实践指导。

通过scRNA-seq技术，研究团队成功鉴定了骨量减少（osteopenia）阶段骨微环境中C2 NR4A1+间充质干细胞（MSCs）这一具有独特代谢特征和分化潜力的细胞亚型。这些MSCs在骨代谢中起着核心作用，不仅能够分泌生长因子，还通过调节免疫反应维持骨组织的稳态和修复能力。研究发现，OPC可以特异性地作用于C2 NR4A1+ MSCs，通过两个相互关联的机制发挥治疗作用：一方面，OPC通过抑制NR4A1的转录活性，降低MSCs中PTGS2（前列腺素内过氧化物合成酶2）的表达；另一方面，OPC能够激活β-连环蛋白依赖的NR4A1–Runx2信号轴，促进成骨分化并抑制破骨细胞的形成。这种双重调控机制为OP的治疗提供了新的思路，即通过精准靶向关键细胞亚型并协调多通路调节，以恢复骨代谢平衡。

为了进一步揭示OPC的作用机制，研究团队利用网络药理学方法，筛选出与OPC相关的靶点基因，并构建了这些靶点蛋白之间的相互作用网络。通过STRING数据库和Cytoscape软件进行可视化分析，研究发现PTGS2在OPC作用网络中处于中心位置，显示出较高的连接度和生物功能重要性。随后，利用ClusterProfiler和ClueGO插件进行基因功能富集分析，结果表明这些靶点基因主要富集于“核质运输的正向调节”和“脂肪细胞中脂解的调节”等生物过程和通路中。这些发现不仅为OPC的生物功能提供了分子层面的解释，也为后续的机制研究和药物开发奠定了基础。

在细胞层面，研究团队通过多种实验方法验证了OPC对MSCs的影响。CCK-8实验表明，OPC能够以剂量依赖的方式增强MSCs的活性，其中10–20 μM的浓度效果最为显著，而40 μM则导致活性略微下降。这提示OPC在MSCs中具有一定的剂量敏感性。此外，划痕实验显示，OPC能够促进MSCs的迁移能力，表明其可能具有促进组织修复和再生的潜力。而克隆形成实验进一步证实了OPC对MSCs增殖的促进作用，特别是在20 μM浓度下效果最佳。这些实验结果表明，OPC可能通过调控MSCs的活性，影响骨代谢的多个环节。

为了深入解析OPC的作用机制，研究团队还进行了转录调控分析。通过pySCENIC软件，研究发现C2 NR4A1+ MSCs在特定的调控模块中具有较高的调控优势，表明其在OPC作用中可能扮演关键角色。此外，研究团队还通过双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）实验，进一步验证了OPC如何通过干扰NR4A1的转录调控来抑制PTGS2的表达。结果表明，OPC能够显著降低PTGS2的表达水平，并且这种抑制作用与NR4A1的活性密切相关。这一发现为理解OPC如何通过调控关键分子来影响骨代谢提供了直接证据。

在动物模型中，研究团队采用卵巢切除（OVX）诱导的骨质疏松模型，评估OPC对骨代谢的调节效果。结果表明，OPC治疗显著改善了骨微结构参数，如骨体积/组织体积比（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁分离度（Tb.Sp），并有效调节了骨代谢标志物，如C-末端胶原蛋白肽（CTX）和前胶原蛋白I N末端前肽（PINP）。这些结果进一步支持了OPC在OP治疗中的潜力。同时，研究还发现，OPC的骨保护作用依赖于β-连环蛋白（β-catenin）的调控，这一发现为OPC的作用机制提供了新的视角，并提示其可能通过调控β-catenin相关的信号通路来实现对骨代谢的调节。

在细胞通讯网络分析方面，研究团队发现C2 NR4A1+ MSCs与成骨细胞之间存在显著的信号交流，特别是在纤维母细胞生长因子（FGF）信号通路中，这种通讯尤为活跃。研究还进一步揭示了FGF7和FGFR1在这一信号通路中的重要作用，表明OPC可能通过调控这些信号分子来影响MSCs与成骨细胞之间的相互作用，从而调节骨代谢平衡。此外，研究还发现，C2 NR4A1+ MSCs在成骨细胞的分化过程中可能发挥重要的调控作用，这一发现为理解MSCs在骨代谢中的功能提供了新的线索。

在讨论部分，研究团队指出，OP的病理核心在于骨代谢的持续失衡，这种失衡不仅源于局部的骨代谢异常，还与全身性的骨微环境失调密切相关。OPC作为天然产物，具有良好的安全性和广泛的应用前景，其作用机制相较于传统药物更为复杂和多维。OPC不仅能抑制破骨细胞的形成，还能促进成骨细胞的分化，同时具备抗炎和抗氧化的特性。这种多通路调节能力使其在OP治疗中展现出独特的优势。

此外，研究团队还强调了MSCs在OP中的关键作用。作为骨微环境中的核心细胞群体，MSCs具有自我更新能力和多向分化潜能，能够分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等多种细胞类型。MSCs的分化失衡，如成骨能力下降或脂肪生成过度，是OP发生和发展的重要驱动力。因此，针对MSCs的精准干预可能成为OP治疗的新方向。C2 NR4A1+ MSCs作为MSCs的一种亚型，其独特的代谢特征和分化能力使其成为OP研究中的关键靶点。

然而，研究也指出了其局限性。首先，虽然OVX模型在一定程度上模拟了绝经后OP的病理特征，但它无法完全反映人类疾病复杂的病理生理过程，因此在临床推论方面仍存在一定的局限性。其次，研究主要关注MSCs及其亚型，对骨微环境中其他细胞类型（如破骨细胞前体和免疫细胞）的相互作用机制尚未深入探讨。此外，目前的样本量较小，且体外实验无法完全模拟体内复杂的生理和微环境条件，因此需要进一步扩大样本量并进行体内实验验证。在临床转化方面，OPC的最佳给药方案、长期安全性以及与其他抗OP药物的协同效应仍需进一步研究，以提高其在慢性疾病治疗中的应用价值。

综上所述，本研究通过整合多种研究方法，系统揭示了OPC在OP治疗中的作用机制，特别是其对C2 NR4A1+ MSCs的精准靶向调控。OPC通过抑制PTGS2的表达和激活β-连环蛋白依赖的NR4A1–Runx2信号轴，实现了对骨代谢的双向调节，从而在成骨和破骨之间维持动态平衡。这一发现不仅为OP的治疗提供了新的分子靶点，也为天然产物在OP治疗中的应用提供了理论依据和实践指导。未来的研究应进一步探索OPC的临床转化路径，包括优化其给药方式、研究其与其他抗OP药物的协同作用，以及开发针对骨微环境的靶向递送系统，以推动OP治疗的个性化和精准化发展。