真皮成纤维细胞培养模型再现了皮肤鼠（dermice）与普通小鼠在对Toll样受体激动剂反应方面的差异

《Frontiers in Immunology》：Dermal fibroblast cultures recapitulate differences between deermice and mice in their responses to a Toll-like receptor agonist

本研究比较了白足鼷和小鼠真皮成纤维细胞对TLR2和TLR4激动剂的免疫反应及基因表达差异。通过bulk和single-cell RNA-seq发现，白足鼷细胞在炎症调控（如低IL-11表达）、端粒酶活性和线粒体代谢基因（Arg1/Nos2比率）上显著不同于小鼠。体外模型有效，白足鼷细胞能长期增殖，且其内源性逆转录病毒（ERV）表达模式更短，翻译潜力较低，可能与免疫耐受和长寿相关。

### 介绍

白足鼠（*Peromyscus leucopus*）是一种在北美地区主要携带莱姆病和其他人畜共患病病原体的宿主。这种动物对所携带的细菌、原生动物和病毒具有感染耐受性。之前的研究显示，白足鼠与小鼠（*Mus musculus*）在接触细菌脂多糖（LPS）后表现出不同的疾病状态和生物标志物谱型。LPS是一种Toll样受体4（TLR4）的激动剂，能够引发急性全身炎症反应。这一现象为研究宿主免疫反应提供了重要的线索，同时揭示了不同物种在应对感染时的生物学差异。

为了更全面地评估哺乳动物的免疫系统，并进行长期实验室研究，我们对白足鼠和小鼠的初级皮肤成纤维细胞进行了研究，评估它们在接触TLR2激动剂脂肽后的短期反应。我们采用批量和单细胞RNA测序技术，以获取更深入的基因表达数据。此外，我们还对白足鼠成纤维细胞的自发转化现象进行了观察，发现其细胞系在标准条件下可以长期维持，而小鼠的成纤维细胞则在有限的传代后失去增殖能力。这一发现提示我们，白足鼠的成纤维细胞在体外环境中具有更高的适应性。

通过这种方法，我们能够更深入地研究这些物种的免疫反应机制，并为未来的实验设计提供依据。白足鼠和小鼠的成纤维细胞在体外环境中表现出不同的基因表达模式，这不仅有助于理解它们的免疫系统特性，也为研究感染耐受性提供了新的视角。此外，通过比较不同传代细胞的表达模式，我们还可以探索细胞在体外适应性变化的潜在机制。

### 方法

为了评估这些物种的免疫反应，我们采用了多种实验方法。首先，我们从不同来源的动物中获取了皮肤组织，并在实验室中进行培养。这些组织包括白足鼠和小鼠的耳部全层组织，经过适当的处理后用于细胞培养。我们采用了一种标准的培养方法，使用RPMI 1640培养基，其中含有10%热灭活胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 μM L-天冬酰胺、50 μM 2-巯基乙醇、250 ng/mL的放线菌素B（amphotericin B）、500 U/mL的青霉素G和500 μg/mL的链霉素。这种培养基的组成能够支持成纤维细胞的生长，并确保实验的可重复性。

在细胞培养过程中，我们首先将组织切成小块，然后将其放入含有胶原酶I的培养基中，以促进细胞的释放。经过一段时间的消化后，细胞被收集并转移到新的培养皿中。通过显微镜观察，我们确认了细胞的形态和生长情况，并记录了它们的增殖能力。在传代过程中，我们通过胰蛋白酶-EDTA溶液释放细胞，并将其重新接种到新的培养皿中，以维持细胞的活性。

为了评估细胞的免疫反应，我们使用了批量和单细胞RNA测序技术。批量RNA测序可以提供整体的基因表达谱，而单细胞测序则能够揭示细胞间的异质性。我们采用了两种不同的TLR激动剂，分别是脂多糖（LPS）和脂肽（Pam3CSK4），并比较了它们在不同物种细胞中的反应。通过这些方法，我们能够更全面地了解这些细胞在面对病原体刺激时的基因表达变化。

### 结果

我们的实验结果显示，白足鼠和小鼠的成纤维细胞在接触TLR激动剂后表现出不同的基因表达模式。首先，我们观察到，白足鼠的成纤维细胞在接触脂肽后，表现出更多的基因上调。这可能与它们的感染耐受性有关，因为这种现象在之前的研究中也曾在血液、脾脏和肝脏中观察到。此外，我们还发现，白足鼠的成纤维细胞在接触脂肽后，表现出更高的Nfe2l2（Nrf2）转录水平，而Nrf2是一种重要的抗氧化转录因子，能够调控多种与细胞保护相关的基因表达。

另一方面，小鼠的成纤维细胞在接触脂肽后，表现出较高的IL-11（一种与衰老相关的细胞因子）转录水平。这表明，小鼠的成纤维细胞可能在感染过程中经历更多的炎症反应，而白足鼠的成纤维细胞则可能通过某种机制抑制这种反应。此外，我们还发现，两种物种的成纤维细胞在接触脂肽后，都表现出某些内源性逆转录病毒（ERV）和转座子（TE）序列的转录增加。然而，小鼠细胞中这些序列的长度通常比白足鼠细胞中的序列更长，并且其潜在的翻译能力也更高。

我们还观察到，白足鼠的成纤维细胞在多次传代后能够自发转化，并形成稳定的细胞系。这与小鼠的成纤维细胞不同，后者在有限的传代后失去了增殖能力。这一现象可能与白足鼠的基因组特性有关，例如其更长的寿命和更强的细胞自主免疫反应。此外，我们还发现，白足鼠的成纤维细胞在接触脂肽后，表现出不同的基因表达谱，这可能与其在自然环境中对病原体的感染耐受性有关。

### 讨论

这些结果表明，使用体外模型可以有效评估哺乳动物的免疫反应，并揭示不同物种之间的差异。白足鼠和小鼠的成纤维细胞在面对TLR激动剂时表现出不同的基因表达模式，这提示我们，它们在免疫系统和细胞自主免疫反应方面存在显著差异。此外，这些差异可能与它们在自然环境中的生存策略有关，例如感染耐受性和长寿。

白足鼠的成纤维细胞表现出更高的Nfe2l2转录水平，这可能与其更强的抗氧化能力有关。Nrf2能够调控多种与细胞保护相关的基因表达，这有助于它们在感染时维持细胞功能。相比之下，小鼠的成纤维细胞表现出更高的IL-11转录水平，这可能与它们在感染时的炎症反应有关。这些发现不仅有助于理解感染耐受性的机制，也为研究衰老相关的免疫反应提供了新的视角。

此外，我们还发现，两种物种的成纤维细胞在接触TLR激动剂后，都表现出某些ERV和TE序列的转录增加。然而，小鼠细胞中的这些序列更长，并且具有更高的翻译潜力。这可能意味着，小鼠的成纤维细胞在面对感染时，能够更有效地激活这些序列，从而引发更强的免疫反应。而白足鼠的成纤维细胞可能通过某种机制抑制这些序列的表达，以减少免疫反应的强度。

这些发现对于研究感染耐受性和衰老相关的免疫反应具有重要意义。白足鼠的感染耐受性可能与其更强的抗氧化能力和更低的炎症反应有关，而小鼠的感染耐受性可能与其不同的基因表达模式有关。此外，这些结果还提示我们，体外模型可以作为研究感染耐受性和免疫反应的有力工具，尤其是在无法进行体内实验的情况下。

### 材料与方法

本研究的动物来源为白足鼠（*Peromyscus leucopus*）和小鼠（*Mus musculus*）。白足鼠来自美国南卡罗来纳州的Peromyscus Genetic Stock Center，采用非近亲繁殖的LL品系。小鼠则来自Charles River Laboratories和Jackson Laboratory，分别为CD-1和FVB/NJ品系。所有动物均在符合国家卫生研究院《实验室动物护理与使用指南》第八版和ARRIVE指南的条件下饲养，以确保实验的伦理标准和可重复性。

在实验过程中，我们对白足鼠和小鼠的耳部组织进行了处理，并将其培养为成纤维细胞。这些组织被切成小块，并在含有胶原酶I的培养基中进行消化。消化后的细胞被收集并转移到新的培养皿中，以维持其活性。我们使用了不同的培养基，包括RPMI 1640培养基，其中含有多种生长因子和抗生素，以确保细胞的健康生长。

为了评估细胞的免疫反应，我们采用了批量和单细胞RNA测序技术。批量RNA测序能够提供整体的基因表达谱，而单细胞测序则能够揭示细胞间的异质性。我们使用了两种不同的TLR激动剂，分别是脂多糖（LPS）和脂肽（Pam3CSK4），并比较了它们在不同物种细胞中的反应。通过这些方法，我们能够更全面地了解这些细胞在面对病原体刺激时的基因表达变化。

在数据处理方面，我们使用了多种工具和方法，包括FastQC用于读取质量分析，Trimmomatic用于低质量读取的修剪，以及CLC Genomics Workbench用于基因组比对和表达分析。我们还采用了Metascape进行基因本体（GO）术语分析，以揭示不同基因表达模式的生物学意义。此外，我们还使用了RepeatMasker对ERV和TE序列进行了注释，并通过BLASTP搜索这些序列的蛋白质产物，以确定它们的潜在功能。

在统计分析方面，我们采用了多种方法，包括配对t检验、Kruskal-Wallis检验和Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正。这些方法能够确保我们对基因表达差异的评估具有统计学意义。此外，我们还使用了SYSTAT软件进行线性回归、相关系数（R2）分析、多维尺度（MDS）分析和一般线性模型（GLM）分析，以揭示不同基因表达模式之间的关系。

在数据资源方面，我们使用了多个公共数据库，包括GenBank、NCBI的SRA和GEO数据库，以及Dryad数据存储库。这些数据库为我们的研究提供了重要的参考，并确保了实验的可重复性和数据的透明性。此外，我们还对某些基因的编码序列进行了手动注释，以提高数据的准确性。

### 结论

本研究通过比较白足鼠和小鼠的成纤维细胞在接触TLR激动剂后的基因表达变化，揭示了它们在感染耐受性和免疫反应方面的差异。这些差异可能与它们的生理特性和生存策略有关，例如感染耐受性和长寿。此外，我们的研究还表明，体外模型可以作为研究感染耐受性和免疫反应的有效工具，尤其是在无法进行体内实验的情况下。通过这些方法，我们能够更深入地理解这些物种的免疫系统特性，并为未来的实验设计提供依据。这些发现不仅有助于感染耐受性的研究，也为衰老相关的免疫反应提供了新的视角。