综述：基于抗体、T细胞受体和适配体的双特异性免疫疗法：作用机制、不良反应与未来展望

《Frontiers in Immunology》：Bispecific immunotherapy based on antibodies, T-cell receptors, and aptamers: mechanisms of action, adverse effects, and future perspectives

本综述系统梳理了抗体、TCR及适配体三类双特异性免疫疗法的设计原理与作用机制，重点分析了其在血液肿瘤和实体瘤中的临床疗效与挑战（如CRS、抗原漂移）。文章展望了通过工程化改造（如掩蔽抗体、多特异性格式）、组合策略（联合CAR-T、免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒）及新型递送平台（如LNP-mRNA）来提升治疗指数的发展方向。

在精准肿瘤学领域，双特异性免疫治疗平台已从实验室原型发展为多中心临床试验的候选药物，开创了新的治疗轨迹。这类分子能同时识别两个不同靶点，通过重定向免疫细胞、阻断关键信号通路和克服免疫逃逸机制，为肿瘤治疗提供了全新策略。

1 引言

免疫治疗在当代肿瘤学中占据核心地位，是精准医学的基石。双特异性免疫疗法作为该领域发展最迅速的方向之一，依赖于能同时识别两个不同靶点的分子。这些构建体通过同时结合肿瘤和效应细胞成分、阻断关键信号通路以及克服免疫逃逸机制，为重定向和激活免疫细胞创造了新机会。迄今为止，已开发出多种双特异性分子格式，包括IgG样抗体、BiTE构建体、基于TCR的设计和适配体杂交体。

双特异性免疫疗法在血液恶性肿瘤中展现出最大治疗价值，如blinatumomab、mosunetuzumab和teclistamab等药物已成为复发难治性疾病的标准治疗方案。近年来，双特异性抗体的应用已扩展至实体瘤，在非小细胞肺癌、神经内分泌肿瘤、葡萄膜黑色素瘤和胆管癌等领域获得批准。

双特异性构建体的主要优势在于其多模式活性，可同时激活免疫细胞并抑制致癌信号通路。然而，这些药物的临床应用仍面临诸多障碍，包括细胞因子释放综合征（CRS）风险、肿瘤组织穿透性差、抗原漂移和工程化挑战。有前景的解决方案包括开发可激活格式、多功能平台以及与免疫检查点抑制剂的联合方案。

2 双特异性抗体的生物学基础和作用机制

2.1 双特异性抗体的结构与主要格式

双特异性抗体（BsAbs）是一类能够同时结合两个不同表位的免疫治疗药物。这种双重特异性不仅能将细胞毒性效应细胞（如T淋巴细胞和NK淋巴细胞）导向肿瘤靶标，还能阻断维持恶性生长和存活的关键信号通路。与识别单一表位的单克隆抗体不同，双特异性构建体具有多靶点活性，这在高度异质性的肿瘤中尤为重要。

BsAbs可分为两大类：缺乏Fc结构域的分子和保留Fc区的全长抗体。第一类包括BiTE、DART和TandAb构建体，它们具有快速的组织扩散能力和强大的细胞毒性。然而，由于其血清半衰期短（缺乏新生儿Fc受体（FcRn）回收机制），需要连续输注或进行工程化改造以延长暴露时间。

全长BsAbs（如DuoBody、CrossMab和κλ-body）采用IgG样结构。Fc片段的存在改善了药代动力学，并赋予Fc介导的效应功能，包括抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。然而，其较大尺寸限制了在实体瘤中的穿透能力，尤其是在缺氧且基质重塑广泛的区域。目前正在开发结合小巧尺寸和长效循环的混合格式（例如通过加入白蛋白结合结构域）来克服这一限制。

现代平台专注于简化链配对和提高产物均一性：CrossMab采用结构域交换，而DuoBody依赖于受控的Fab臂交换。同时激活T细胞和NK细胞并递送免疫调节剂（如IL-15）的多功能构建体（如TriKEs和四特异性抗体）也日益受到关注。精细调整抗原亲和力以最小化对健康组织的结合仍是关键优先事项。此外，正在研究仅在肿瘤微环境（由低pH或蛋白酶活性触发）内具有功能的条件活性格式，以增强选择性并降低全身毒性。

尽管工程学取得了显著进展，但稳定性、聚集和产物异质性方面的挑战依然存在。解决这些问题的策略包括Fc修饰、基于纳米技术的递送系统以及促进表达和正确组装的序列优化。

2.2 双特异性抗体的主要作用机制

双特异性抗体（BsAbs）的免疫治疗潜力源于其重定向细胞毒性效应细胞、阻断免疫检查点和破坏维持肿瘤生长存活的信号网络的能力。

临床上最重要的机制是T细胞重定向。BiTE构建体（如blinatumomab）将CD3⁺ T淋巴细胞与肿瘤细胞接触，形成免疫突触，触发穿孔素和颗粒酶介导的靶细胞凋亡。由于其活性不依赖于MHC呈递和共刺激，这些分子具有广泛的治疗范围；调整CD3亲和力可以减轻细胞因子释放综合征（CRS）。类似地，NK细胞衔接器（例如AFM13，靶向CD30/CD16A）通过FcγRIIIa激活NK细胞，诱导ADCC。在三特异性格式（TriKEs）中加入IL-15进一步促进NK细胞增殖和持久性。

在信号层面，BsAbs触发T细胞中ZAP-70、LAT和PLCγ1的磷酸化，导致Ca²⁺动员、NFAT激活和MAPK/ERK通路参与；在NK细胞中，它们激活SYK和PI3K，驱动颗粒胞吐以及IFN-γ和TNF-α的合成。

共同靶向免疫检查点（例如PD-1/CTLA-4、PD-1/LAG-3、PD-1/TIGIT）的BsAbs能够在限制全身过度激活的同时，实现更局部的免疫激活。同时阻断PD-1和PD-L1的IBI318增强了T细胞的再激活，而同时靶向PD-1和CTLA-4的MGD019降低了如LAG-3和TIM-3等耗竭标志物的表达。

另一种作用模式涉及直接阻断致癌信号。Zenocutuzumab（靶向HER2/HER3）抑制携带NRG1融合基因的肿瘤中的PI3K/AKT级联反应。Amivantamab（靶向EGFR/MET）结合了受体抑制和ADCC，在具有EGFR exon 20插入的非小细胞肺癌中显示出疗效。

针对可溶性细胞因子的BsAbs也引起关注。同时阻断PD-L1并中和TGF-β的M7824（bintrafusp alfa）对肿瘤微环境产生协同调节，并恢复T细胞活性。在自身免疫和炎症性疾病中，共同中和TNF-α和IL-17的BsAbs对银屑病和克罗恩病有效。同时抑制IL-4和IL-13为哮喘提供了一种有前景的策略，比dupilumab提供了更全面的Th2抑制。

2.3 双特异性抗体的靶细胞

当前双特异性抗体（BsAbs）的主要细胞靶点是T淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞。它们强大的细胞毒性和功能异质性能够诱导多方面的抗肿瘤免疫反应。

T细胞仍然是BsAb疗法的核心焦点，特别是以T细胞衔接器的形式同时结合CD3和肿瘤相关抗原。这些构建体形成人工免疫突触，激活不依赖于MHC的信号级联，并诱导IFN-γ、TNF-α、穿孔素和颗粒酶的分泌。BiTE分子在B细胞白血病中已证明临床疗效。下一代全长双特异性抗体（如teclistamab、glofitamab和tarlatamab）显示出改善的药代动力学，并在多发性骨髓瘤、淋巴瘤和肺癌中显示出有希望的结果。然而，这种方法伴随着风险，包括CRS、神经毒性以及在“冷”肿瘤微环境中活性降低。当前的优化策略侧重于两个关键方面：第一，精确调整CD3结合亲和力，以平衡抗肿瘤活性和最小的全身毒性；第二，分子的空间工程，确保抗原结合位点之间的最佳域间距离，这对于在肿瘤微环境内形成有效的突触和选择性T细胞激活至关重要。

NK细胞能够进行不依赖于MHC的肿瘤细胞杀伤。靶向CD16A和肿瘤抗原的BsAbs启动涉及SYK和PI3K的激活级联，并触发IFN-γ和TNF-α的释放。AFM13（CD30×CD16A）在霍奇金淋巴瘤中显示出疗效，而AFM24（EGFR×CD16A）正在研究用于实体瘤的治疗。三特异性分子如GTB-3550（CD33×CD16A×IL-15）不仅激活NK细胞，还刺激其增殖。开发的关键参数包括调整CD16A亲和力以防止NK细胞耗竭，以及根据治疗目标定制Fc结构域。尽管具有自身免疫并发症风险低等优势，基于NK细胞的方法受到效应细胞寿命短和潜在功能耗竭的限制。

γδ T细胞是通过Vγ9Vδ2-TCR和NKG2D受体激活的、不依赖于MHC的T细胞亚群。它们识别应激诱导的配体（如MICA和MICB），并主动分泌促炎细胞因子。桥接γδ-TCR和肿瘤抗原的γδ T细胞衔接器（GABs）在临床前模型中显示出疗效。然而，在免疫抑制微环境中，γδ T细胞可能获得调节特性并表达抑制性受体（如PD-1和LAG-3），限制其抗肿瘤功能。

巨噬细胞和树突状细胞作为BsAb开发的新兴靶点日益受到关注。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）常采用免疫抑制性M2表型，促进肿瘤进展。CD47–SIRPα轴是一个关键的治疗靶点；其阻断可恢复吞噬活性。共同靶向CD47和肿瘤抗原（例如HER2）的BsAbs能够在最小化对健康细胞的脱靶效应的同时，选择性激活巨噬细胞。替代方法包括CSF1R抑制，促进TAMs向抗肿瘤M1样表型复极化。

树突状细胞，特别是cDC1亚群，是适应性免疫反应的重要启动者。靶向CLEC9A和DEC-205等受体能够将抗原精确递送至交叉呈递区室。包含CD40特异性的双特异性构建体增强DC成熟并促进IL-12产生，这对于Th1细胞和CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞的激活至关重要。这些策略为对常规疗法耐药的肿瘤提供了有效的免疫启动途径。

2.4 双特异性抗体的临床应用与未来展望

自20世纪末出现以来，双特异性T细胞衔接器（BiTEs）已成为血液恶性肿瘤的关键治疗方式。Blinatumomab（CD19×CD3）是该类别中首个获得FDA批准的药物——最初于2014年用于微小残留病变，随后于2017年用于复发或难治性急性淋巴细胞白血病（ALL），实现了高完全缓解率和改善的生存结果。随后，开发了包含Fc结构域的全长双特异性IgG分子以改善药代动力学。Mosunetuzumab（CD20×CD3）在至少接受过两线治疗后复发的滤泡性淋巴瘤中获得批准，总缓解率（ORR）达到80%。Teclistamab（BCMA×CD3）成为首个获批用于复发/难治性多发性骨髓瘤的双特异性抗体，ORR约为63%。类似药物包括epcoritamab（CD20×CD3）和elranatamab（BCMA×CD3），均在B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤中显示出显著活性。首个靶向GPRC5D的talquetamab（CD3×GPRC5D）实现了约73%的ORR。Glofitamab（CD20×CD3）以其增强的T细胞激活和有限治疗周期（12个周期）为特点，在复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中报告ORR为52%，完全缓解率（CR）为39%。

在实体瘤中，一个里程碑是tarlatamab（DLL3×CD3）获批用于小细胞肺癌。该药物靶向DLL3，显示出40%的ORR和14个月的中位总生存期。Amivantamab（EGFR×MET）获批用于具有EGFR exon 20插入的非小细胞肺癌（NSCLC），结合了双重受体阻断和Fc介导的细胞毒性。

在肿瘤学之外，BsAbs在其他疾病中也具有治疗作用。Emicizumab（FIXa×FX）获批用于A型血友病的预防，是首个能够模拟因子VIII活性的皮下、非酶促药物。

迄今为止，几种双特异性抗体已获得FDA批准用于临床，强调了它们的治疗相关性和安全性。这些药物涵盖血液和实体恶性肿瘤，反映了可靶向平台的多样性。

双特异性免疫肿瘤学的发展持续快速推进。Zanidatamab（HER2×CD3）在HER2阳性胃肠道癌和乳腺癌中显示出有前景的疗效。Pasotuxizumab（PSMA×CD3）在去势抵抗性前列腺癌中显示出高达19%的ORR，而zolbetuximab-CD3（Claudin18.2×CD3）在胃肠道恶性肿瘤中达到28%的ORR。Zenocutuzumab（HER2×HER3）在携带NRG1基因融合的患者中显示出令人鼓舞的活性。多特异性平台的进展包括开发具有整合细胞因子模块的三特异性和四特异性构建体，以增强抗肿瘤反应。一个最近的例子是四特异性衔接器IPH6501，它结合了CD20靶向、NK细胞激活（NKCE）和改良IL-2变体的递送。该构建体在B细胞非霍奇金淋巴瘤的临床前模型中展示了选择性NK细胞激活和强大的抗肿瘤活性，强调了将细胞因子信号整合到多特异性平台中的前景。

许多构建体处于后期临床开发阶段，包括CD20×CD3、BCMA×CD3、GPRC5D×CD3和CD123×CD3，主要用于血液适应症。在实体瘤中，新兴药物靶向HER2×HER3、PD-1/PD-L1和CTLA-4。几个候选药物显示出良好的安全性（例如CRS ≤ 3级）和方便的给药方案，包括每2-3周皮下给药。

3 基于T细胞受体的双特异性构建体

3.1 设计原理与作用机制

基于T细胞受体（TCR样和TCR工程化）的双特异性抗体代表了一类创新的分子，能够识别在肽-MHC复合物背景下呈递的细胞内肿瘤抗原。这些构建体通过模拟天然TCR的特异性，克服了常规抗体仅限于靶向表面抗原的局限性。它们的结合域通常由经过工程化以增强亲和力和特异性的scFv或Fab片段组成。此类分子的开发依赖于噬菌体展示、定向进化和CDR优化，并需仔细关注交叉反应性，这仍然是一个关键问题。

其作用机制涉及选择性结合肿瘤特异性肽-MHC复合物，导致免疫突触形成和随后的T细胞激活。参与细胞内信号级联（ZAP70、LAT、PLCγ1）最终导致转录因子（如NFAT）的表达和细胞毒性效应物的分泌。这种方法对于靶向肿瘤特异性肽（如WT1、MAGE-A3和NY-ESO-1）在HLA-A*02:01背景下呈递时特别有效。

TCR样构建体需要严格验证以确认等位基因特异性并确保安全性。肽序列或MHC等位基因的变异会显著影响结合，需要使用免疫肽组学和正常组织筛选来识别潜在的脱靶相互作用。虽然增强的亲和力有助于检测低丰度靶标，但过高的亲和力可能增加脱瘤毒性的风险。

通过定点诱变和合理设计可以提高稳定性和药理学性能，包括替换疏水残基、修饰CDR环以及开发在肿瘤微环境中选择性激活的前药形式。TCR样抗体的应用受到其对特定HLA等位基因依赖性的限制，这促使了针对常见等位基因（尤其是HLA-A*02:01）的广泛应用构建体的开发。

最先进的临床平台是ImmTAC，它使用工程化TCR与抗CD3效应结构域融合以进行T细胞衔接。ImmTAC分子以对肽-MHC复合物的高敏感性为特征，并已显示出针对低表达靶标的活性。一个里程碑式的例子是tebentafusp，它获得FDA批准用于转移性葡萄膜黑色素瘤，并在III期临床试验中显著改善了总生存期。

3.2 临床前与临床实例

TCR样和TCR工程化双特异性抗体的开发通过实现对与MHC分子复合的细胞内抗原的识别，为癌症免疫治疗开辟了新途径。这些构建体与仅限于表面抗原的常规BsAbs相比，显著拓宽了治疗前景。最早的例子之一是ESK1，一种在HLA-A*02:01背景下特异性靶向WT1的TCR样抗体。在临床前模型中，ESK1显示出选择性细胞毒性和良好的安全性，而临床研究证实了其体内特异性靶向肿瘤的能力。

迄今为止临床上最先进和最成功的例子是tebentafusp，一种针对gp100/HLA-A*02:01的ImmTAC分子。通过将亲和力增强的TCR结构域与抗CD3效应臂结合，tebentafusp能够实现有效的T细胞募集和肿瘤控制。在一项关键的III期试验中，tebentafusp显著改善了转移性葡萄膜黑色素瘤患者的总生存期，标志着该疾病的首个有效疗法。

针对癌睾抗原（如NY-ESO-1和MAGE-A1）的TCR基双特异性抗体在临床前系统中也显示出高效力。这些在正常组织中表达受限的抗原被证明具有免疫原性且是安全的靶标；特异性构建体引发了强大的T细胞反应，且毒性最小。针对PRAME（一种在实体瘤中广泛表达的致癌抗原）的分子也获得了类似的结果。PRAME/HLA-A*02:01特异性构建体显示出选择性细胞毒性和有前景的临床活性。

靶向MART-1已成为展示精细TCR工程的基准。CDR环的诱变和框架区的优化显著增强了对肿瘤相关表位的结合选择性，同时最小化了对正常黑素细胞的识别。类似的工程策略正被用于开发针对AFP、突变p53和病毒表位（如HPV E6）的构建体，从而实现病毒相关癌症的应用。

3.3 TCR基双特异性构建体的生产与稳定性挑战

基于T细胞受体（TCR样和TCR工程化）的双特异性抗体的开发伴随着一系列独特的生物工程和制造挑战。一个主要障碍是实现对肽-MHC复合物的高特异性，同时最小化交叉反应性。这需要多步骤优化流程，通常采用噬菌体或酵母展示平台进行候选物筛选。然而，即使特征明确的分子也需要使用正常组织面板和免疫肽组库进行广泛的临床前验证，以评估潜在的脱靶相互作用。

另一个主要挑战在于TCR结构域固有的不稳定性，容易聚集和错误折叠。为了缓解这些问题，采用结构工程，包括引入稳定突变和二硫键，以及仔细选择支持天然折叠和热稳定性的分子格式（如scFv、Fab或IgG支架）。聚集仍然是一个特别关键的问题，因为它会降低生物利用度，增加免疫原性，并使生物制造复杂化。解决方案包括合理诱变和优化长期储存的缓冲液组成。

免疫原性代表了另一个障碍。修饰的TCR结构域可能引发抗药物抗体（ADA）反应，从而降低治疗效果。使用人源化序列和最小化非人表位是降低免疫原性潜力的关键策略。

在制造放大阶段，必须特别关注治疗剂量所需的高蛋白质浓度下的分子稳定性。由于表面疏水性，TCR基平台在浓度高于50 mg/mL时容易聚集。这需要定制的缓冲系统、稳定赋形剂和优化的浓缩方案。

对于运输和储存，耐物理化学和机械应力至关重要。使用精氨酸盐酸盐和基于氨基酸的稳定剂进行配制、使用无硅酮注射器和冻干技术等策略有助于在长期储存期间保持分子完整性。

3.4 TCR样/TCR工程化与常规双特异性抗体的临床差异

TCR样或TCR工程化双特异性抗体与常规BsAbs之间的临床差异在比较其作用机制、疗效特征和安全性特征时变得尤为明显。传统的BsAbs（如blinatumomab）对表达高密度表面抗原的肿瘤表现出强大的活性——这一特性体现在它们在B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）中的成功。然而，它们的治疗效果高度依赖于抗原表达的稳定性和密度，使其在抗原丢失或下调的情况下效果较差。相比之下，TCR样和TCR工程化抗体能够识别由MHC分子呈递的细胞内肿瘤衍生肽。这使得能够靶向非表面抗原，包括新抗原和病毒蛋白，将其应用范围扩展到表面抗原表达低或免疫原性谱隐藏的肿瘤（如肉瘤、黑色素瘤和选定的血液恶性肿瘤）。一个典型的例子是tebentafusp，它在转移性葡萄膜黑色素瘤患者中显示出统计学上显著的生存获益。

这些平台的安全性特征也显著不同。常规BsAbs（尤其是BiTEs）与高比率的细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性相关，这是由于广泛的多克隆T细胞激活。例如，高达70%的blinatumomab治疗患者出现CRS，15-20%的病例发生神经毒性事件。相比之下，TCR样构建体通常不诱导系统性T细胞激活，但具有与源自正常组织的肽交叉反应相关的独特风险。针对MAGE-A3的TCR结构域已报道严重的毒性，包括心肌炎和心脏毒性。

现代工程方法通过微调亲和力、优化CDR区域和多层特异性验证来帮助减轻这些风险。针对WT1、PRAME和NY-ESO-1的构建体已证明，仔细的分子设计可以实现高选择性和可接受的安全性特征。

尽管存在技术复杂性、生产成本高以及需要HLA匹配的患者群体等挑战，TCR样药物代表了免疫治疗武器库中的重要补充。

4 双特异性适配体：设计原理与治疗潜力

4.1 适配体的结构与优势

适配体是能够折叠成稳定三维结构（如发夹、假结和G-四链体）的短单链DNA或RNA分子，使其能够高亲和力、高特异性结合分子靶标，包括蛋白质、肽、核酸和小分子。由于其紧凑的结构和结构灵活性，适配体正在成为靶向递送和分子识别应用中抗体的有吸引力的替代品。

适配体的一个关键优势在于其选择方法——SELEX（通过指数富集的配体系统进化），允许从庞大的核苷酸库中体外鉴定高亲和力结合物。与抗体不同，适配体不需要在活细胞中表达，简化了生产，提高了纯度，最小化了批次间差异，并促进了低成本下的可扩展性。由于分子量小（5-15 kDa），适配体表现出快速的组织穿透（包括肿瘤），非常适合诊断和治疗应用。然而，其小尺寸也导致快速肾脏清除和短循环半衰期。采用聚乙二醇化、白蛋白结合和纳米颗粒包裹等策略来延长系统持久性。此外，化学修饰（如2'-氟取代或硫代磷酸酯连接）可增强核酸酶抗性并降低免疫原性。

虽然适配体传统上不是双特异性药物，但它们可以被设计来执行双特异性功能。双特异性适配体（bsApts）是设计用于同时结合两个不同靶标的合成寡核苷酸——通常是肿瘤相关抗原和免疫细胞受体（例如CD3、CD28、4-1BB）。它们代表了一种有前景的抗体替代品，特别是在小尺寸和低免疫原性有利的情况下。分子工程的最新进展使得能够将单特异性适配体转化为双特异性构建体，从而扩展了它们在免疫治疗中的效用。

关键的工程策略包括二价适配体格式和混合适配体-抗体融合物。例如，靶向免疫检查点（如PD-1和CTLA-4）的二价bsApts在重新激活T细胞反应中已证明协同效应。这些构建体保留了核心适配体优势（小尺寸和低免疫原性），同时获得了类似双特异性抗体的功能。在混合设计中，特异性靶向肿瘤抗原的适配体模块与抗体片段（例如抗CD3 scFv）融合，能够以类似于BiTEs的方式募集T细胞。临床前模型已验证了