Gitelman综合征患者尿液外泌体中的miRNA表达：hsa-let-7d-3p的作用

《The FASEB Journal》：The miRNA Expression of Urinary Extracellular Vesicles in Patients With Gitelman Syndrome: The Role of hsa-let-7d-3p

Gitelman综合征（GS）由SLC12A3基因突变导致钠氯共转运体（NCC）功能异常，引起盐分流失和电解质失衡。本研究通过尿外泌体（uEVs）和肾活检组织的小RNA测序，发现uEVs中20种miRNA上调、23种下调，肾组织中30种上调、23种下调，其中4种miRNA（hsa-let-7d-3p、hsa-miR-362-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-30b-5p）同时在两者中表达差异。hsa-let-7d-3p是唯一上调的miRNA，通过靶向NEDD4L基因负调控其表达，导致集合管中钠通道ENaC降解减少，促进钠重吸收。验证实验显示，敲入Ncc突变的小鼠模型中NEDD4L表达降低，且荧光素酶报告基因实验证实hsa-let-7d-3p直接抑制NEDD4L转录。uEVs可作为GS的非侵入性生物标志物，揭示miRNA介导的离子转运调控机制。

Gitelman综合征（GS）是一种罕见的遗传性肾小管疾病，其主要特征是由于SLC12A3基因发生失活突变，导致钠氯共转运蛋白（NCC）功能受损，从而引发盐分流失和电解质紊乱。这种疾病主要表现为低钾血症、低镁血症、低钙尿症以及代谢性碱中毒，通常在青少年至成年早期出现，症状包括肌肉无力、疲劳、口渴、夜尿增多等。GS的诊断通常依赖于直接的Sanger测序或下一代测序，但目前对GS中肾小管转运蛋白的表观遗传调控机制，尤其是微小RNA（miRNA）的作用，仍缺乏深入研究。

为了更全面地理解GS的分子机制，本研究首次利用尿液来源的细胞外囊泡（uEVs）进行小RNA测序，并结合肾活检组织分析，探索了miRNA在GS中的表达模式及其可能的调控作用。研究结果表明，从uEVs中检测到358种miRNA，其中20种在GS患者中显著上调，23种显著下调；而在肾活检组织中则发现了652种miRNA，其中30种上调，23种下调。在这两项分析中，共有4种miRNA在uEVs和肾组织中同时表现出变化，包括hsa-let-7d-3p、hsa-miR-362-5p、hsa-miR-30c-5p和hsa-miR-30b-5p。值得注意的是，hsa-let-7d-3p是唯一在uEVs中显著上调的miRNA，并且在肾小管中显示出与NEDD4L调控相关的生物学功能。

NEDD4L是一种重要的蛋白，参与钠通道（ENaC）的降解过程。在正常情况下，NEDD4L通过泛素化和降解ENaC，调节钠的重吸收。然而，在GS患者中，由于NCC功能障碍，导致钠的流失，这可能促使NEDD4L的表达下降，从而减少ENaC的降解，增加钠的重吸收。这一机制可能有助于解释GS患者为何会出现钠的异常保留，尽管他们总体上表现出盐分流失的症状。此外，hsa-let-7d-3p被发现能够负向调控NEDD4L的表达，这在体外双荧光素酶报告基因实验中得到了验证。该实验显示，当hsa-let-7d-3p被引入时，NEDD4L的表达水平显著降低，而当该miRNA的结合位点被突变后，其调控作用则消失。这一发现进一步支持了hsa-let-7d-3p在GS中可能扮演的调控角色。

研究还通过Ncc敲除小鼠模型验证了这一机制。在这些小鼠的肾组织中，NEDD4L的表达明显减少，而hsa-let-7d-3p的表达则显著升高。这表明，miRNA的表达变化可能与GS的病理生理机制密切相关，并且uEVs中的miRNA可以作为非侵入性的生物标志物，用于评估GS患者的肾小管转运功能。这一研究不仅揭示了miRNA在GS中的潜在作用，还为未来开发新的诊断和治疗策略提供了理论依据。

在实验方法方面，研究团队首先从GS患者和健康对照组中收集尿液样本，并通过一系列步骤提取uEVs。包括使用cOmplete EDTA-free蛋白酶抑制剂防止蛋白降解，通过离心去除细胞碎片，使用Vivaspin turbo 15浓缩样本，最后利用ExoQuick-TC沉淀溶液获得uEVs。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电镜（TEM）和免疫印迹等技术，验证了uEVs的纯度和特征。随后，利用miRNeasy micro kit提取小RNA，并通过Illumina NextSeq 550平台进行小RNA测序。数据处理采用GENEGLOBE在线软件和DESeq2进行标准化和差异表达分析，以确保结果的可靠性。

为了进一步探索miRNA对NEDD4L的调控作用，研究团队还利用miRWalk和TargetScan数据库预测了这些miRNA的靶基因，并结合基因本体（GO）分析，确定了它们在调控钠离子转运和膜去极化过程中的潜在作用。其中，hsa-let-7d-3p的靶基因包括NEDD4L，而NEDD4L的表达变化与ENaC的活性密切相关。这一发现不仅揭示了miRNA在肾小管功能调节中的作用，还为理解GS的分子机制提供了新的视角。

尽管本研究取得了重要进展，但仍然存在一些局限性。首先，GS作为一种罕见疾病，其样本量相对较小，可能影响统计分析的效力。其次，uEVs中的miRNA通常表达水平较低，这可能会影响多重检验的稳定性。此外，虽然本研究在体外验证了hsa-let-7d-3p对NEDD4L的调控作用，但需要进一步的体内研究来确认这些相互作用在临床中的实际意义。最后，缺乏盐分流失或其他相关疾病的对照组，限制了研究结果的特异性分析。未来的研究应考虑纳入更多不同类型的疾病对照组，以更准确地评估miRNA在GS中的特异性变化。

总体而言，本研究通过分析uEVs和肾组织中的miRNA表达，揭示了miRNA在GS病理生理过程中的潜在作用。尤其是hsa-let-7d-3p通过抑制NEDD4L的表达，可能在调节ENaC活性方面发挥关键作用，从而影响钠的重吸收。这一发现不仅加深了对GS发病机制的理解，还为利用uEVs作为非侵入性生物标志物提供了新的思路。未来，随着更多研究的开展，miRNA在肾小管疾病中的调控机制有望被进一步阐明，从而为临床诊断和治疗提供更有效的工具。