USP32通过调控PKM2稳定性与糖酵解代谢促进颞下颌关节骨关节炎的新机制

《Cell Death & Disease》：USP32 promotes temporomandibular joint osteoarthritis by modulating PKM2 stability and glycolytic metabolism in chondrocytes

本研究针对颞下颌关节骨关节炎（TMJOA）中软骨细胞代谢紊乱的机制展开探索，发现去泛素化酶USP32通过特异性去除PKM2的K48和K11连接泛素链，稳定PKM2蛋白水平，增强糖酵解活性，导致乳酸积累和线粒体功能障碍，最终加剧软骨细胞凋亡和细胞外基质降解。靶向USP32-PKM2轴可显著缓解TMJOA病理进展，为代谢干预治疗提供了新靶点。

颞下颌关节是人体中最复杂的关节之一，当其发生骨关节炎（Osteoarthritis, OA）时，会导致关节软骨退化、疼痛和功能障碍，严重影响患者的生活质量。在众多类型的颞下颌关节疾病中，颞下颌关节骨关节炎（TMJOA）作为一种退行性疾病，其发病机制尚未完全阐明。软骨细胞作为关节软骨中唯一的细胞类型，负责细胞外基质（ECM）的合成与维持，而软骨细胞的死亡是软骨降解的重要标志。然而，由于软骨组织缺乏血管和淋巴引流，自我修复能力极为有限，这使得TMJOA的治疗面临巨大挑战。

近年来，代谢改变在OA发病中的作用逐渐受到关注。在健康的软骨细胞中，糖酵解、氧化磷酸化和有氧糖酵解维持着精细的平衡。一旦这种平衡被打破，便可能通过破坏细胞微环境而加速OA的进展。其中，丙酮酸激酶M2（PKM2）作为糖酵解过程中的关键酶，不仅参与能量代谢，还能进入细胞核调节多种促糖酵解酶的表达，甚至参与炎症过程的调控。值得注意的是，PKM2的二聚体和四聚体形式之间的转换对线粒体功能、内质网应激及其他蛋白的调节具有重要影响，其中二聚体形式与基因调控密切相关。尽管PKM2在癌症领域已被广泛研究，但它在OA中的作用仍存在争议，尤其是在TMJOA中的具体机制及其与去泛素化修饰的调控关系尚不明确。

另一方面，泛素化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，参与细胞信号转导、命运决定、炎症反应及关键细胞组分的降解等生物学过程。而去泛素化酶（DUBs）则能逆转这一过程，通过去除蛋白质上的泛素分子，维持细胞内稳态。在DUBs的最大家族——泛素特异性蛋白酶（USP）家族中，USP32已被报道在癌症、神经退行性疾病、内体运输调控和自噬等过程中发挥作用，然而其在TMJOA中的功能尚未有研究涉及。

为了回答上述问题，西安交通大学口腔医院的研究团队在《Cell Death and Disease》上发表了最新研究成果，揭示了USP32通过调控PKM2稳定性影响TMJOA进展的新机制。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过单侧前牙反颌（UAC）大鼠模型模拟TMJOA病理进程；从3周龄SD大鼠颞下颌关节分离原代下颌髁突软骨细胞（MCCs）进行体外实验；利用腺相关病毒（AAV）介导的软骨特异性USP32敲降进行体内功能验证；通过免疫共沉淀（Co-IP）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术鉴定USP32与PKM2的相互作用；采用环己酰亚胺追踪实验和MG132处理评估蛋白质稳定性；使用Seahorse能量代谢分析系统检测细胞糖酵解功能。

USP32上调加剧TMJOA软骨细胞凋亡

通过建立UAC大鼠模型，研究人员发现TMJOA软骨组织呈现进行性软骨丢失、基质减少和软骨下骨退化。免疫组化分析显示IL-1β表达显著上调，同时细胞外基质重塑相关指标发生改变，MMP13表达增加，而ACAN和Col2a1水平下降。凋亡标记物Cleaved caspase 3、Bax以及TUNEL阳性软骨细胞均显著增加。进一步分析表明OA软骨中ATP耗竭而乳酸积累，线粒体膜电位降低提示功能受损。转录组测序发现，与蛋白去泛素化（GO:0016579）和泛素化（GO:0016567）相关的差异表达基因（DEGs）显著富集，其中USP32（Fold change=2.06）在软骨组织中表达显著上调，且呈现时间依赖性增加。

软骨特异性敲低USP32缓解TMJOA退行性变

为了明确USP32在TMJOA中的功能，研究人员通过AAV介导的软骨特异性USP32敲降发现，USP32敲低后凋亡标记物Bax、Cleaved caspase 3和ECM降解指标Mmp13表达均显著降低，而Col2a1表达增加。Micro-CT分析显示软骨下骨结构明显改善，组织学评估表明软骨厚度增加，OARSI评分降低，蛋白聚糖含量提高。免疫组化证实USP32敲低有效抑制了IL-1β表达，TUNEL阳性软骨细胞减少，代谢平衡恢复，ATP产生增加，乳酸和丙酮酸积累减少。透射电镜显示线粒体形态部分恢复，表明USP32抑制可通过减少凋亡、正常化代谢改变和维持线粒体完整性来缓解OA进展。

USP32调控炎症软骨细胞的凋亡和代谢改变

在细胞水平上，IL-1β处理可显著诱导MCCs中MMP13、Bax和Cleaved caspase 3的上调，同时降低Col2a1和ACAN水平，并伴随USP32表达增加。USP32沉默可逆转这些效应，减少基质降解和凋亡相关蛋白表达。凋亡实验显示炎症条件下软骨细胞凋亡比例升高，USP32敲低后显著降低。活性氧（ROS）水平在炎症软骨细胞中升高，线粒体膜电位丢失，而USP32敲低后ROS水平下降，线粒体膜电位恢复，ATP产生部分恢复，乳酸释放减少。相反，USP32过表达进一步增强了凋亡相关基因和ECM降解标记的表达，同时降低Col2a1水平，加重线粒体功能和能量代谢障碍。

USP32与PKM2相互作用

作为去泛素化酶，USP32通过调节底物蛋白的泛素化状态来调控其功能和稳定性。通过Co-IP和LC-MS，研究人员鉴定出5个与USP32相互作用的关键代谢相关蛋白，其中PKM2与USP32存在稳定相互作用。在MCCs中证实了USP32与PKM2的结合，且炎症刺激增强了它们的结合。共转染实验进一步证实了这一直接相互作用。通过AlphaFold预测和截断突变体实验，发现USP32特异性结合PKM2的桶状结构域（aa 1-375）。

USP32通过去泛素化稳定PKM2

机制研究表明，炎症刺激导致USP32和PKM2蛋白水平增加，但USP32沉默不影响PKM2的mRNA表达。环己酰亚胺追踪实验结合MG132处理证明USP32通过抑制蛋白酶体降解来降低PKM2蛋白的降解速率。炎症条件下PKM2泛素化减少，蛋白表达增加；而USP32沉默导致PKM2泛素化增加，蛋白水平降低。泛素连接分析证实USP32通过切割K48和K11连接的泛素链来调控PKM2。此外，USP32显著稳定了PKM2的四聚体和二聚体形式，其中对四聚体形式的稳定作用更为明显。

USP32-PKM2轴通过糖酵解代谢驱动软骨细胞炎症反应

为了明确USP32是否通过调控PKM2发挥炎症效应，研究人员在USP32过表达的炎症软骨细胞中共转染siPKM2。PKM2的遗传抑制可有效逆转ECM降解，恢复Col2a1表达，抑制Mmp13、ADAMTs和凋亡指标。这一干预还改善了软骨细胞活力和线粒体功能，正常化了代谢扰动，表现为丙酮酸和乳酸积累减少，ATP产生恢复。此外，USP32特异性增强糖酵解活性，表现为ECAR和糖酵解能力增加，而这些效应完全依赖于PKM2。体内免疫组化分析显示TMJOA中PKM2水平在USP32敲低后降低，间接验证了USP32对PKM2的体内影响。

除了参与糖酵解，PKM2还可能影响炎症软骨细胞中的基因转录。为了特异性研究USP32的糖酵解调控，研究人员使用竞争性糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）直接比较代谢和转录效应。糖酵解抑制显著减弱了USP32过表达的影响，增加Col2a1表达，同时降低ECM降解和凋亡相关蛋白。2DG处理还增强了软骨细胞活力，表现为凋亡减少、线粒体膜电位恢复和ROS水平降低。此外，乳酸和丙酮酸释放减少，ATP合成增强。

研究结论与意义

本研究首次揭示了USP32在TMJOA软骨组织和IL-1β诱导的软骨细胞中显著上调，通过增强糖酵解和促进软骨细胞凋亡参与OA进展。USP32特异性靶向PKM2的桶状结构域，选择性切割K11和K48连接的泛素链，从而稳定PKM2并增强其糖酵解活性。这一新发现填补了我们对USP32在软骨炎症中作用的认识空白，揭示了OA发病中一个新的代谢调控机制。

尽管先前研究已证实去泛素化过程通过NF-κB激活、ER应激诱导、NLRP3调节和SOX9调控等机制调节软骨细胞炎症，但本研究首次将USP32识别为TMJOA中的新型调节因子。与肿瘤和免疫细胞中的研究不同，本研究首次将USP32与细胞代谢调控联系起来，为USP32对软骨细胞的代谢影响及其在OA中的意义提供了新见解。

在代谢重编程方面，本研究证实了软骨细胞中从氧化磷酸化向糖酵解的转变通过PKM2等关键酶介导，导致乳酸积累和ATP产生减少。值得注意的是，2DG处理减轻了炎症和凋亡，与先前研究一致。本研究首次报道USP32作为去泛素化酶稳定PKM2的二聚体和四聚体形式，其中对四聚体的稳定作用尤为显著。PKM2二聚体和四聚体的病理性积累可能通过二聚体介导的氧化还原失衡和四聚体驱动的高活性糖酵解共同破坏代谢稳态。

该研究不仅阐明了USP32-PKM2轴在TMJOA发病中的关键作用，还为OA干预提供了新的潜在治疗靶点。通过靶向这一轴心，可能有望开发出针对TMJOA的代谢干预策略，为改善患者预后和生活质量提供新思路。