基于不对称化学修饰DNA探针的双靶标CRISPR-Cas12诊断新策略

《Journal of Genetics and Genomics》：Dual-target CRISPR-Cas12 diagnostics based on asymmetrically chemical-modified DNA probe

本研究针对CRISPR诊断技术难以实现单管多靶标检测的瓶颈，开发了基于Cas12i与AapCas12b对不对称硫代磷酸酯修饰ssDNA探pt探针具有相反反式切割偏好的新特性，成功构建单管双靶标核酸检测平台。该平台在HPV16/HPV18和FluA/RSV病毒分型中展现出高特异性与灵敏度，临床样本检测率达100%，为多重病原体检测提供了创新解决方案。

在传染病防控领域，快速精准的病原体检测技术是阻断传播链条的关键。传统核酸检测方法如定量PCR虽灵敏度高，但设备依赖性强；新兴的环介导等温扩增（LAMP）技术虽简化了操作，却常因非特异性扩增导致假阳性结果。CRISPR基因编辑技术的出现为分子诊断带来了革命性突破——其Cas蛋白在识别特定核酸序列后会被激活反式切割（trans-cleavage）活性，可无差别切割周围报告分子，实现信号放大。然而当面临多种病原体混合感染时，如何在单反应管内同时检测多个靶标仍面临巨大挑战。

近日发表于《Journal of Genetics and Genomics》的研究论文“Dual-target CRISPR-Cas12 diagnostics based on asymmetrically chemical-modified DNA probe”提出创新解决方案。该研究首次发现Cas12i与AapCas12b两种核酸酶对不对称硫代磷酸酯（phosphorothioate）修饰的单链DNA探针具有截然相反的反式切割偏好性，据此构建了单管双靶标检测平台，在病毒分型与临床检测中展现出卓越性能。

关键技术方法包括：通过体外转录制备crRNA（CRISPR RNA），采用不对称硫代磷酸酯修饰的ssDNA荧光探针，结合环介导等温扩增（LAMP）技术对临床样本（18例流感A病毒样本来自中山大学孙逸仙纪念医院）进行核酸扩增，利用实时荧光监测系统评估Cas12蛋白的反式切割效率。

The analysis of the trans-cleavage activity of Cas12i

研究团队通过系统评估Cas12i的反式切割活性，发现其与经典诊断工具Cas12a具有相似动力学特征。通过优化crRNA二级结构及反应体系组分（如添加甜菜碱），显著提升了Cas12i的检测灵敏度，为后续多重检测奠定基础。

Discussion

研究表明基于Cas12i和AapCas12b的差异化探针切割特性，可有效规避传统Cas12/Cas13混合体系存在的RNA探针不稳定性与交叉干扰风险。该平台在HPV16/HPV18和FluA/RSV分型中实现100%临床样本检出率，证实其具备临床转化潜力。

Preparation of dsDNA activators and probes

研究详细阐述了双链DNA激活剂与修饰探针的制备流程，采用Q5高保真酶合成特定基因片段（如CHEK2、XBP及HPV靶序列），通过琼脂糖凝胶电泳纯化获得高纯度激活剂，确保检测特异性。

Ethical Statement

所有临床样本均经中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会批准（伦理批件号：2024-SSKY-238-01），符合医学研究伦理规范。

Data availability

本研究相关数据集可根据合理需求向通讯作者获取，体现了科学研究的可重复性原则。

研究结论表明，该双靶标检测平台不仅拓展了CRISPR-Cas12蛋白在多重核酸检测中的应用边界，更通过化学修饰探针技术突破了现有检测体系对RNA探针的依赖。其模块化设计可与多种等温扩增技术联用，为现场快速检测（point-of-care testing）提供了新范式。值得注意的是，研究团队已就相关技术申请专利保护，预示着该项创新具有明确的产业化前景。

这项工作的科学价值在于揭示了不同Cas12蛋白对化学修饰核酸的酶学特性差异，为开发更复杂的多重检测系统提供了理论依据。未来通过挖掘更多Cas蛋白家族成员的特异性，有望实现单管内超多重病原体同步检测，最终推动精准医疗向基层医疗场景渗透。