蛋白质人工动粒诱饵技术：靶向HURP微管竞争机制防治卵母细胞衰老相关染色体错误分离

《Nature Cell Biology》：Designing protein-based artificial kinetochores as decoys to prevent meiotic errors in oocytes

本研究针对卵母细胞减数分裂中衰老相关的染色体提前分离难题，设计了一种基于蛋白质的人工动粒诱饵（NDC80FL-GEM-Linker）。该诱饵通过竞争HURP标记的微管纤维，有效减弱染色体动粒所受的微管拉力，从而在衰老小鼠卵母细胞中阻止减数分裂I期和II期的染色体提前分离，显著降低非整倍体卵子发生率。该策略为辅助生殖技术中防治年龄相关卵母细胞错误提供了新路径。

随着女性生育年龄的推迟，年龄相关的卵母细胞质量下降已成为生殖医学领域的重大挑战。在卵母细胞减数分裂过程中，染色体错误分离是导致流产和先天性疾病（如唐氏综合征）的主要原因。衰老卵母细胞中染色体黏连蛋白（cohesin）的减弱，使得染色体在减数分裂中期难以抵抗纺锤体微管的拉力，导致同源染色体或姐妹染色单体提前分离。尽管这一问题已被广泛认识，但有效预防染色体提前分离的策略仍属空白。

近日，日本理化学研究所（RIKEN）的Tomoya S. Kitajima团队在《Nature Cell Biology》发表了一项突破性研究，他们设计出一种蛋白质基人工动粒（artificial kinetochore）作为“诱饵”，成功阻止了衰老卵母细胞减数分裂中的染色体错误。该研究为防治年龄相关卵母细胞非整倍体提供了新思路。

研究团队采用的主要技术方法包括：利用基因编码荧光多聚体（GEM）纳米颗粒（直径约40纳米）作为蛋白质支架构建人工动粒；通过雷帕霉素（rapamycin）诱导的FKBP-FRB二聚化系统控制蛋白质簇组装；使用共聚焦显微镜进行活细胞四维成像跟踪染色体和人工动粒动态；通过免疫荧光染色分析HURP标记的动粒微管附着状态；采用自然衰老小鼠（60-95周龄）卵母细胞作为年龄相关减数分裂错误模型。

设计蛋白质基动粒样颗粒

研究团队以能够独立建立类双取向（biorientation-like）状态的NDC80-NUF2异源二聚体为核心，将其与GEM纳米颗粒结合，构建出亚微米尺度的NDC80^ASPC-GEM簇。这些颗粒通过NDC80蛋白的环结构域（loop domain）介导自组装，形成直径约500纳米的簇状结构。

设计NDC80^ASPC-GEM颗粒簇

通过引入两端带有FKBP结构域的连接蛋白（Linker），研究人员成功将NDC80^ASPC-GEM簇的尺寸进一步扩大，形成了NDC80^ASPC-GEM-Linker簇，其荧光强度和直径均显著增加。

尺寸相关的NDC80^ASPC-GEM簇排列

活体成像显示，无Linker的NDC80^ASPC-GEM簇大多定位于纺锤体极，而带有Linker的簇则显著提高了在纺锤体赤道板（metaphase plate）附近的排列能力。约80%的排列簇能在后期开始前维持其位置超过60分钟，并沿纺锤体轴呈现伸长形态，提示其受到双向微管拉力。

SPC24-SPC25结合域改善NDC80^ASPC-GEM簇排列

使用全长NDC80（NDC80^FL）构建的NDC80^FL-GEM-Linker簇能够招募内源性动粒蛋白CENP-T，形成更大的簇结构，并表现出更高效的排列能力。这些簇在纺锤体赤道板附近保持相对稳定的位置，且其伸长形态在单极纺锤体诱导剂monastrol处理后迅速缩短，证实其受到双向微管拉力的作用。

NDC80^FL-GEM-Linker簇可建立类双取向状态

免疫荧光分析显示，排列在赤道板的NDC80^FL-GEM-Linker簇有相当一部分与HURP标记的微管纤维形成双向附着。当用proTAME延长中期I时，绝大多数排列簇都建立了稳定的HURP阳性微管双向附着，表明其能够建立类双取向状态。

NDC80^FL-GEM-Linker簇不与染色体竞争赤道板内部位置

与微米级的NDC80微珠不同，亚微米级的NDC80^FL-GEM-Linker簇不会优先定位于赤道板内部区域，也不影响染色体的正常定位。这种尺寸特性使其在发挥功能的同时避免了染色体定位异常。

NDC80^FL-GEM-Linker簇与动粒竞争HURP标记的微管纤维

NDC80^FL-GEM-Linker簇显著减少了染色体动粒附着的HURP微管纤维的厚度，但不增加染色体错排或非整倍体发生率。当使用微管结合活性更高的NDC80-9A突变体时，这种竞争效应更加明显，且导致染色体错排增加，证实了人工动粒与染色体动粒对有限微管资源的竞争机制。

NDC80^FL-GEM-Linker簇阻止衰老卵母细胞延长中期I的染色体提前分离

在衰老小鼠卵母细胞中，雷帕霉素诱导的NDC80^FL-GEM-Linker簇显著降低了延长中期I的染色体提前分离频率，而不影响正常染色体的排列。过表达HURP会增加染色体提前分离，进一步证实了人工动粒通过竞争HURP微管纤维发挥保护作用的机制。

NDC80^FL-GEM-Linker簇抑制衰老卵母细胞正常减数分裂I的染色体错误分离

在未受干扰的减数分裂I过程中，NDC80^FL-GEM-Linker簇显著降低了中期II卵母细胞中动粒数量异常（非40个）的发生率，表明其能有效抑制染色体错误分离，减少非整倍体卵子的产生。

NDC80^FL-GEM-Linker簇阻止衰老卵母细胞正常中期II的姐妹染色单体提前分离

在衰老卵母细胞的中期II，姐妹染色单体提前分离比中期I的染色体提前分离更为普遍。NDC80^FL-GEM-Linker簇显著降低了中期II卵母细胞中提前分离的染色单体数量，减小了配对姐妹动粒间的距离，但不影响正常染色单体的排列。

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