疱疹病毒解旋酶-引物酶结构与抑制机制的重大突破——为新一代抗病毒药物研发铺平道路

《Nature Microbiology》：Structural and mechanistic insights into herpesvirus helicase–primase and its therapeutic inhibitors

本研究针对疱疹病毒治疗中核苷类似物耐药性和无法彻底阻断复发的临床难题，通过冷冻电镜技术首次解析了HSV-1解旋酶-引物酶复合物的高分辨率结构，明确了Pritelivir和Amenamevir两种抑制剂的精确结合位点，揭示了其非竞争性变构抑制机制，为开发广谱抗疱疹病毒药物提供了关键结构基础。

在全球范围内，数十亿人感染至少一种人类疱疹病毒，这些病毒建立终身感染，在免疫抑制个体中可能引发危及生命的并发症。尽管核苷类似物如阿昔洛韦(acyclovir)长期以来作为标准治疗，但其无法完全阻断生殖器疱疹复发，且耐药株在免疫抑制患者中不断出现，凸显了开发新型抗病毒策略的迫切需求。

疱疹病毒复制机制中，解旋酶-引物酶(helicase-primase, HP)复合物作为位于病毒DNA聚合酶上游的关键组件，负责解旋双链DNA并在滞后链上沉积RNA引物，成为极具潜力的抗病毒靶点。然而，由于缺乏HP复合物的高分辨率结构信息以及对HP抑制剂(helicase-primase inhibitors, HPIs)作用机制理解不完整，开发高效小分子HPIs的进展一直受到阻碍。

在这项发表于《Nature Microbiology》的研究中，科学家们通过冷冻电镜(cryo-EM)技术成功解析了HSV-1 HP复合物的精细结构，包括未结合状态的"apo"结构(3.8 ?)以及与两种临床活性HPIs——Pritelivir(PTV)和Amenamevir(AMNV)结合的结构(均为3.2 ?)。这一突破性工作揭示了尽管PTV和AMNV在化学结构上差异显著，但它们结合于HP复合物中由UL52的α13和α32螺旋、UL5的α17螺旋以及UL5基序IV环共同构成的同一口袋。

研究团队采用的主要技术方法包括：利用昆虫细胞表达系统纯化HSV-1 HP三组分复合物；建立生化DNA解旋活性测定体系评估抑制剂效力；通过冷冻电镜解析多种状态下的复合物结构；进行剂量递增耐药性研究筛选耐药突变；利用细菌人工染色体(BAC)系统构建重组病毒验证突变体表型。

整体结构解析揭示HP复合物独特架构

研究人员成功纯化了由UL5解旋酶、UL52引物酶和UL8辅助蛋白组成的稳定异源三聚体复合物，该复合物在体外具有功能性双链DNA解旋活性，并可被PTV和AMNV有效抑制，IC₅₀值分别为11.1 nM和3.5 nM。冷冻电镜结构显示，UL5解旋酶包含超家族1(superfamily 1, SF1)解旋酶特有的七个保守基序，UL8采用典型的DNA聚合酶样折叠，而UL52引物酶形成长达130 ?的弓形结构，其AEP域和N端域位于两端，通过螺旋束连接。

HPI结合口袋的精细映射

结构分析表明，尽管化学结构不同，PTV和AMNV均结合于同一口袋。AMNV呈Y形构象，而PTV更为伸展。极性相互作用在锚定两种化合物中起主要作用，特别是UL5 K356与PTV的乙酰胺羧基氧或AMNV的氨基-2-氧代乙基氧之间的氢键。对HPI结合口袋的精细映射与过去二十年间发表的体外耐药数据高度一致。

体外耐药性研究验证结构模型

剂量递增耐药性研究显示，在HSV-1研究中出现了UL5 K356N变异，而在HSV-2研究中检测到UL5 K355R变异（单独或与UL5 L805I和UL52 A906V组合）。将UL5 K355N引入重组HSV-2病毒导致对PTV的敏感性显著降低(210倍)，而携带所有三个替代(UL5 K355R、L805I和UL52 A906V)的重组病毒对PTV几乎不敏感(EC₅₀变化>1,300倍)。

HPIs作用机制的深入阐释

为了阐明HPIs的分子作用机制，研究人员尝试解析HSV-1 HP复合物与分叉DNA和ATP-γ-S结合的结构（含PTV和不含PTV）。含PTV的样品产生了分辨率良好的PTV密度，但缺乏DNA和ATP-γ-S密度，类似于底物游离的HSV-1 HP复合物与PTV结合的状态，构象变化极小。而无PTV的含底物样品产生了柔性区域的中间分辨率图谱。

比较含PTV和不含PTV的结构发现，UL52的螺旋束和N端域以及UL5围绕两个近乎垂直的轴发生了显著的旋转运动，这些轴在PTV结合位点附近汇聚。这些运动通过促进极性接触和π-π堆积相互作用，稳定了UL52 α32和UL5基序IV及α17，这些区域在没有PTV时是无法解析的。

将HSV-1 UL5核心与其他SF1解旋酶叠加显示基序定位几乎相同，这使得单链DNA(single-stranded DNA, ssDNA)和腺苷-5'-(β,γ-亚氨基)三磷酸(ADPNP)能够移植到UL5-PTV结构上。作为SF1B解旋酶，UL5结合的DNA沿5'-3'方向运行，穿过2A结构域顶部，然后横穿1A结构域，将解旋的DNA定位在UL52催化位点附近。建模的ADPNP占据UL5核苷酸结合位点，该位点与其他SF1解旋酶中的核苷酸结合排列相似。

值得注意的是，ADPNP位于PTV结合位点附近，由UL5基序IV环分隔，该环采用与RecD2 ADPNP结合的基序IV环相似的构象。该环与两侧的配体相互作用：R345与ADPNP的β-和γ-磷酸相互作用，类似于在RecD2、ATPases、GTPases和RecQ解旋酶中发现的精氨酸指(argining finger)，而相邻的N343与PTV的吡啶氮形成氢键。基序IV环的双重相互作用提示了一种非竞争性变构抑制机制。确实，PTV在不与DNA或ATP竞争的情况下破坏了HSV-1 HP的ATP驱动的DNA解旋活性。

通过比较UL5-PTV结构（建模有ADPNP）与RecD2解旋酶在底物(ADPNP结合)和产物(ADPNP游离)状态下与ssDNA结合的结构，进一步研究了PTV和AMNV介导的抑制机制。作为SF1B解旋酶，UL5与RecD2共享高度保守的核心基序和四个结构域，尽管2B结构域由于柔性仍大部分未解析，且1B结构域由于序列同源性有限而不太明确。这种相似性表明UL5可能使用类似RecD2的尺蠖式易位机制。

在RecD2中，ATP水解驱动2A、2B和1A结构域的协调构象变化，其中最显著的位移发生在核苷酸结合位点附近。ADPNP结合引起1A结构域基序IV的显著重排，包括180°翻转和R493移动约20 ?。基序IV可能发生与ATP水解周期同步的振荡运动，驱动1A结构域的功能动力学。此外，在UL5中，基序IV和R345采用几乎相同的ATP结合位置，提示类似的构象变化。然而，在PTV结合结构中，N343与PTV吡啶之间的氢键限制了环的流动性，阻止了ATP驱动的重排。此外，UL5 K356在1A结构域的α17螺旋上与PTV的乙酰胺接头形成强稳定的氢键，阻止了ATP水解所需的半螺旋螺距移动，类似于在RecD2等效的α16螺旋中观察到的移动。UL5-AMNV复合物显示出相当的稳定性，N98、N343和K356与AMNV的恶二唑和氨基-2-氧代乙基接头形成氢键，外加来自E359的额外键。这些相互作用共同限制了基序IV和1A结构域的动力学，从而抑制了ATP驱动的易位。

研究结论与意义

本研究通过冷冻电镜数据不仅证实了PTV和AMNV结合于HP复合物的同一口袋，还揭示了其通过限制基序IV和1A结构域动力学来抑制ATP驱动易位的变构抑制机制。结构数据结合UL5/UL52氨基酸序列保守性分析，阐明了当前HPIs抗病毒谱受限的分子基础。例如，HSV-1中关键的HPI结合残基UL52 A899在VZV中为缬氨酸，这种A-to-V替代在HSV-2中对PTV产生中等耐药性(17倍)而不影响AMNV效力，解释了PTV及其类似物与AMNV相比抗病毒谱较窄的原因。

该研究强调了存在于所有已知HPIs中的乙酰胺羧基氧与HSV-2 UL5 K355相互作用的重要性，使得它们容易在此位置出现耐药变异。因此，在当前和未来的临床试验中应仔细监测此位置的替代。同时，研究指出将当前HPI支架的抗病毒谱扩大至覆盖巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)尤其困难，因为CMV HP复合物中几个HPI结合残基缺乏保守性。

尽管多种HPIs被证明同时抑制解旋酶和引物酶活性，强调了UL5和UL52亚基在HSV-1 HP复合物中的相互依赖性，但PTV和AMNV与UL52相互作用而不直接损害其催化位点的结构完整性，因此尚不清楚它们的结合是否以变构方式抑制引物酶活性。阐明这一机制的未来研究对于开发靶向病毒解旋酶、引物酶或两者的更有效化合物具有重要价值。

这项研究首次提供了疱疹病毒HP复合物与临床相关抑制剂结合的高分辨率结构视图，为理解HPIs的作用机制和耐药性发展提供了分子基础，将极大地促进针对疱疹病毒和其他相关病原体的下一代抗病毒药物的合理设计。