rAAV转染生产过程中的异质性限制生产效率：基于单细胞转录组学的HEK293细胞机制解析

《Scientific Reports》：Heterogeneity in an adeno-associated virus transfection-based production process limits the production efficiency

本研究针对rAAV（重组腺相关病毒）基因治疗载体在瞬时转染生产中存在的低效问题，通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术揭示了HEK293细胞中质粒基因表达的显著异质性。研究发现仅约8%的细胞高表达所有三种必需质粒基因，且仅3%的细胞能成功组装rAAV9衣壳。通过轨迹推断分析，团队明确了细胞周期（S期）、免疫应答及蛋白质错误折叠是影响生产效率的关键因素，为通过细胞周期同步化等策略提升rAAV产量提供了理论依据。

基因治疗作为现代医学的革命性领域，重组腺相关病毒（rAAV）因其非致病性、低免疫原性和长期表达特性成为最常用的载体之一。然而，其临床应用仍面临巨大挑战：单次治疗剂量需10¹²–10¹⁵病毒基因组，而现有生产工艺效率低下，导致成本超百万美元，严重限制了可及性。瞬时转染是rAAV生产的主流技术，但存在转染效率低（30–80%）、质粒表达不一致及空衣壳比率高等问题。尽管工艺优化不断推进，细胞水平的生物学瓶颈尚未明确，亟需从单细胞层面解析限制因素。

为揭示生产瓶颈，Brian Ladd等团队在《Scientific Reports》发表研究，首次将单细胞RNA测序（scRNA-seq）应用于HEK293细胞的rAAV9瞬时转染过程。研究通过对比贴壁和悬浮培养模型，结合流式细胞术与qPCR滴度检测，系统分析了细胞异质性对生产效率的影响。

关键技术方法

研究采用三重质粒（pHelper、pRepCap、pGOI）聚乙烯亚胺（PEI）转染HEK293T细胞，分别于转染后12小时和48小时取样。通过单细胞RNA测序（BD Rhapsody平台）解析细胞亚群转录特征，辅以轨迹推断（Slingshot算法）追踪细胞状态演变；利用流式细胞术检测细胞内组装衣壳（AAV9特异性纳米抗体染色），并通过qPCR定量病毒基因组滴度。

研究结果

1. 病毒产量与细胞表现

贴壁与悬浮培养的细胞裂解液滴度均约为2000 vg/细胞，但悬浮培养上清液滴度（10⁸ vg/mL）显著高于贴壁培养（10⁷ vg/mL），表明培养方式影响病毒释放效率。

2. 质粒基因表达异质性

scRNA-seq聚类分析显示，仅54%的细胞同时表达三种质粒基因，其中仅8%（悬浮）和5%（贴壁）表现为高表达。高达46%的细胞缺失至少一种质粒基因表达，且该比例随时间推移略有下降。

3. 细胞内病毒组装效率

流式细胞术检测发现，仅2.5%的细胞含有高水平的细胞内组装rAAV9衣壳，与高质粒基因表达细胞比例高度一致，证实低转染效率是生产瓶颈。

4. 细胞轨迹与关键通路

轨迹推断将细胞分为α（高表达）和β（低表达）谱系。α谱系细胞呈现S期特征，伴随G2/M期相关基因（如染色体分离）的早期上调及G1/S过渡相关基因（如钾离子转运）的晚期激活；β谱系细胞则早期激活免疫应答与错误蛋白折叠反应。基因富集分析表明，高表达细胞依赖S期进程，而低表达细胞受免疫应激和蛋白稳态失衡抑制。

结论与意义

本研究通过单细胞分辨率揭示了rAAV生产中转染异质性的核心限制：少数S期细胞主导病毒生产，而免疫应答与蛋白错误折叠阻碍多数细胞参与高效合成。这一发现为优化工艺提供了新方向，如通过细胞周期同步化提升转染效率、调控免疫通路减轻细胞应激反应。研究不仅深化了对rAAV生产生物学的理解，更凸显了单细胞技术在新兴生物制造领域的应用潜力，为降低基因治疗成本奠定了关键理论基础。