融合质谱与高光谱成像技术：恶性胶质瘤中原卟啉IX检测的新策略

《Scientific Reports》：Integrating mass spectrometry and hyperspectral imaging for protoporphyrin IX detection in malignant glioma tissue

本研究针对5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）诱导的原卟啉IX（PpIX）荧光引导手术在低浸润区肿瘤细胞检测灵敏度不足的难题，开发了基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）与高光谱成像（HI）的双重检测体系。通过猪脑组织模型验证发现，LC-MS可精准定量PpIX（准确度98-137%），而HI虽能快速成像却系统性高估浓度（平均超估6-9倍）。研究首次实现人脑胶质瘤活检中PpIX与粪卟啉（Cp I/III）同步定量，证实PpIX是主要荧光来源，为优化HI算法、提升术中肿瘤边界识别精度提供了关键数据支撑。

在神经外科领域，高级别胶质瘤（HGG）的治疗如同一场与时间的赛跑，最大程度的安全切除肿瘤是延长患者生存期的关键。然而，这类肿瘤具有弥漫性浸润生长的特性，其边界如同雾中花、水中月，难以清晰界定。为了照亮这片“灰色地带”，神经外科医生们引入了一种名为5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）荧光引导手术（FGS）的技术。患者术前口服5-ALA，其在肿瘤细胞内会转化为一种名为原卟啉IX（PpIX）的光敏物质，在特定波长的蓝紫色光照射下会发出醒目的红色荧光，如同为外科医生提供了“肿瘤荧光导航”。

然而，现有的手术显微镜存在灵敏度不足的短板，对于肿瘤细胞密度较低的区域，其荧光信号微弱难以捕捉，这直接导致了肿瘤残留和近乎不可避免的复发。大约85%的肿瘤会在切除腔附近复发，凸显了在浸润区精准识别肿瘤组织的极端重要性。高光谱成像（HI）技术应运而生，它能够捕获更宽波长范围的光谱信息，并通过算法解析，理论上能比人眼或传统设备更灵敏地检测到PpIX。但HI作为一种仍在发展中的技术，其定量准确性一直缺乏可靠的“金标准”进行验证。它测得的荧光信号是否真的只代表PpIX？是否会受到其他结构相似的卟啉类物质（如粪卟啉I和III， Cp I/III）的干扰？其读数能否真实反映组织中的PpIX浓度？这些问题亟待回答。

为了解决这些核心问题，来自德国明斯特大学医院的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的研究成果。他们巧妙地扮演了“裁判”角色，将能够提供绝对定量结果的液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术引入，作为评估HI性能的可靠标尺。研究团队设想，如果能够先在一个成分可控的模型上建立起两种技术测量结果之间的准确对应关系，那么就能用这种关系来校准和解读在真实、复杂的人体组织样本上的HI测量数据。他们选择了猪脑组织作为理想的“模拟战场”（替代基质），通过将已知量的PpIX精确加入均质化的猪脑组织中，制备出不同浓度的样本，并同时用LC-MS和HI进行测量比对。在成功建立并验证了这套方法之后，他们将其应用于真实的临床场景——分析了9名接受5-ALA介导的肿瘤切除术的HGG患者的27份活检组织。

为开展本研究，作者主要应用了几项关键技术：1. 液相色谱-质谱联用（LC-MS）定量分析：建立了同时检测PpIX和Cp I/III的高灵敏度、高特异性方法，并以中卟啉（MpIX）作为内标，用于获取组织中的绝对浓度值。2. 高光谱成像（HI）系统：使用定制的高光谱显微镜系统（基于OPMI pico显微镜，配备405 nm LED光源和sCMOS相机），在420-730 nm波长范围内以3 nm步长采集离体组织样本的荧光光谱数据，并通过算法解析得到PpIX的相对贡献值。3. 猪脑替代基质模型：利用市售猪脑制备均质组织，用于方法学开发、校准和建立LC-MS与HI测量值之间的换算关系。4. 临床样本队列分析：研究对象为9名HGG患者（8例胶质母细胞瘤，1例少突胶质细胞瘤WHO 3级）的27份新鲜活检组织（源自原发或复发肿瘤），术前均口服5-ALA（20 mg/kg），并由外科医生在KINEVO 900显微镜下对荧光强度（无/强）进行分级。

LC-MS分析粪卟啉——方法开发

研究人员首先优化并验证了能够同时精准测定PpIX以及其潜在干扰物Cp I和Cp III的LC-MS/MS方法。由于Cp I和Cp III是分子量相同的异构体，质谱本身无法区分，但通过反相液相色谱，成功实现了两者的基线分离，从而能够分别定量。该方法灵敏度高，对PpIX的定量下限（LOQ）达到每毫克组织4飞摩尔（fmol/mg）。

猪脑分析

在猪脑替代模型上的研究为后续分析奠定了坚实基础。结果表明，从脑组织中提取PpIX的回收率高达80%，而Cp I和Cp III的回收率约为45%。LC-MS方法在0.01至7.0 pmol/mg的浓度范围内表现出优异的线性、精密度（变异系数5-14%）和准确度（98-137%）。相比之下，HI的准确度（77-121%）和精密度（变异系数11-31%）虽可接受，但已显示出与LC-MS的差异。

MS和HI分析加标猪脑替代物

关键的比对实验结果显示，在猪脑匀浆中，当PpIX加标浓度高于0.04 pmol/mg时，LC-MS测量结果与真实值高度吻合。而HI测量值（HI_Calc-PpIX）虽然与加标浓度存在线性关系，但已经呈现出系统性高估的趋势（见图3）。这一发现在均质的模型组织中已初现端倪，提示HI算法本身可能存在偏差。

HI和LC-MS测量临床活检组织

对27份人HGG活检组织的分析得出了本研究最核心的发现。尽管两种技术测得的PpIX浓度之间存在显著的线性正相关（皮尔逊相关系数0.858），但HI值系统地、且经常是显著地高于LC-MS值。在术中被评为“无”荧光的10份活检中，HI值平均高出LC-MS值约8.9倍，个别样本甚至高出34倍。在17份“强”荧光活检中，HI值的平均高估倍数也为5.5倍（见表4）。此外，LC-MS成功在所有活检中（包括无荧光样本）检测到了PpIX和Cp，证实了即使在肉眼不可见的浸润区域也存在PpIX的积累。数据分析表明，PpIX是5-ALA诱导的荧光的主要来源，Cp的浓度远低于PpIX（约十分之一），但其浓度在荧光强的活检中也更高。

讨论

本研究通过引入LC-MS这一“金标准”方法，首次对HI在检测脑肿瘤组织PpIX方面的性能进行了严格的、定量化的评估。研究最重要的结论是：当前使用的HI算法会系统性高估组织中的PpIX浓度，尤其是在低浓度区间（这对肿瘤边界划定至关重要）和高浓度区间都存在此现象。这种高估可能源于多种因素：HI测量的是组织表面（深度约100-250 μm）的荧光，而LC-MS检测的是整个组织的平均浓度；组织的光学特性（如吸收、散射）和自身荧光会影响HI信号；不同卟啉物质光谱重叠的干扰；以及PpIX在肿瘤复杂微环境（如不同pH、缺氧状态）下可能存在的不同物理化学状态（如单体、聚集体）对其荧光特性的影响。

尽管存在高估，HI在检测肉眼不可见荧光区域的PpIX方面展现了巨大潜力，其快速、无损的优势是LC-MS无法比拟的。本研究的意义在于为HI技术的优化提供了明确的靶点和可靠的校准基准。研究人员已经意识到这一问题，并开始着手改进，例如开发基于深度学习的算法，利用LC-MS提供的“真实”浓度数据来校正HI的光谱数据处理过程，从而减少系统性偏差。

结论

本研究成功建立了一种结合高特异性LC-MS和高空间分辨率HI的综合分析策略，用于精确评估恶性胶质瘤组织中的PpIX。研究明确指出了当前HI技术在定量准确性方面的局限性，即系统性高估PpIX浓度，这可能影响术中肿瘤边界的精确判定。同时，研究证实PpIX是5-ALA诱导荧光的主要来源，Cp的贡献相对较小。这些发现为HI技术的进一步开发和优化提供了至关重要的实验依据和方向指导。通过积累更多基于LC-MS等绝对定量方法的参考数据，并用于改进HI的信号处理和算法，有望最终实现HI在神经外科手术中实时、准确区分肿瘤与健康组织的宏伟目标，从而帮助外科医生更彻底地切除肿瘤，改善高级别胶质瘤患者的预后。