Dnmt1通过调控生长板软骨细胞能量代谢决定骨长度的表观遗传机制

《Nature Communications》：Dnmt1 determines bone length by regulating energy metabolism of growth plate chondrocytes

本研究针对软骨细胞分化过程中DNA甲基化维持机制如何调控骨骼形成的科学问题，系统探讨了DNA甲基转移酶Dnmt1在长骨生长中的关键作用。研究人员通过条件性基因敲除小鼠模型结合多组学分析，发现Dnmt1缺失导致生长板软骨细胞增殖减少而矿化加速，其机制涉及能量代谢相关基因的去抑制和代谢物水平改变。该研究首次揭示了表观遗传调控通过协调能量代谢决定骨长度的新机制，为骨骼发育异常疾病的治疗提供了新靶点。

在骨骼发育的奇妙世界中，生长板软骨细胞如同精密的工程师，通过复杂的分化过程构建着我们身体的支架。然而，这个过程的调控机制仍有许多未解之谜，特别是表观遗传调控如何影响软骨细胞命运决定和骨骼形成。DNA甲基化作为最重要的表观遗传修饰之一，在细胞分化和发育中起着关键作用，但其在软骨细胞分化和骨骼形成中的具体功能尚不清楚。

DNA甲基转移酶Dnmt1是维持DNA甲基化的核心酶，在维持基因组稳定性和细胞身份中不可或缺。虽然此前研究发现Dnmt1与膝关节骨关节炎和矿化过程相关，但它在骨骼形成，特别是在软骨细胞中的功能仍不明确。更引人深思的是，Musculoskeletal Knowledge Portal中的基因关联分析显示DNMT1与身高显著相关，这提示Dnmt1可能在骨骼发育中扮演着重要角色。

为了解开这一谜题，爱媛大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项开创性研究，系统阐述了Dnmt1通过调控软骨细胞能量代谢来决定骨长度的新机制。

研究人员主要运用了条件性基因敲除技术、多组学整合分析（包括RNA测序和甲基化DNA富集测序）、代谢组学分析、细胞能量代谢测定以及组织学分析等关键技术方法。其中，人软骨细胞样本来源于膝关节置换手术中废弃的关节软骨组织。

缺乏Dnmt1的Prrx1-Cre小鼠出生后长骨生长停滞

研究人员首先通过生物信息学分析确认了DNMT1基因位点与身高的显著关联，随后构建了肢体间充质细胞特异性Dnmt1条件性敲除小鼠（Dnmt1^△Prx1）。令人惊讶的是，与对照组Dnmt1^flox小鼠相比，Dnmt1^△Prx1小鼠从出生起就表现出长骨明显缩短，且这种差异随着年龄增长而加剧。到16周时，突变小鼠的骨长不足对照组的一半。通过细胞特异性敲除实验，研究人员确认这一表型主要源于软骨细胞而非成骨细胞。

Dnmt1^△Prx1生长板中加速的分化过程

组织学分析显示，Dnmt1和Uhrf1在增殖区软骨细胞中均有表达，而Dnmt1^△Prx1小鼠中Dnmt1表达几乎完全缺失，Uhrf1表达也显著降低。软骨组织染色发现突变小鼠胫骨近端增殖软骨面积显著减小，矿化区域明显增宽。到6周龄时，Dnmt1^△Prx1小鼠出现生长板丢失和小梁骨形成异常。

Dnmt1缺陷增强软骨细胞矿化

原代培养的软骨细胞实验进一步证实了体内观察到的现象。Dnmt1缺陷软骨细胞表现出增殖减慢、软骨基质合成减少，但矿化过程加速。基因表达分析显示早期软骨细胞分化标志物Col2a1表达下降，而晚期分化标志物如Runx2以及成骨细胞分化相关基因表达上升。

Dnmt1直接调控能量代谢相关基因

整合RNA测序和MBD测序分析发现，Dnmt1缺陷导致全基因组DNA甲基化水平降低，进而引起能量代谢相关基因表达上调。研究人员鉴定出123个因Dnmt1缺失而去抑制的基因，这些基因显著富集在免疫系统、钙化和分解代谢等通路。特别值得注意的是，与能量代谢密切相关的Noct、Slc38a6、Rab3gap1和Sirt5等基因表达显著上调。

Dnmt1通过能量代谢调控钙化

功能实验表明，Dnmt1缺陷软骨细胞的谷氨酰胺摄取和线粒体代谢显著增强，几乎所有的能量代谢物水平都升高，包括S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和2-酮戊二酸（2KG）。去除培养基中的葡萄糖、谷氨酰胺和丙酮酸可抑制异常矿化，而TCA循环抑制剂也能逆转Dnmt1缺陷引起的矿化增强。体内实验进一步证实，glutaminase抑制剂CB839处理可减少Dnmt1^△Prx1小鼠的骨小梁形成。

人软骨细胞中DNMT1缺陷加速能量代谢和分化

在人软骨细胞中敲低DNMT1也观察到类似现象：早期软骨分化标志物表达下调，晚期分化标志物表达上调，线粒体活性增强。这表明Dnmt1调控软骨细胞能量代谢的机制在人类中同样保守。

这项研究系统揭示了Dnmt1介导的DNA甲基化维持通过调控能量代谢基因表达和代谢物供应，从而控制软骨细胞分化和骨骼发育的新机制。研究发现，Dnmt1缺陷导致DNA甲基化水平降低，引起能量代谢相关基因去抑制表达，同时减少SAM和2KG的消耗，共同导致细胞内能量代谢异常增强，进而加速软骨细胞矿化和分化，最终导致长骨生长受阻。

该研究的创新之处在于首次将表观遗传调控与能量代谢联系起来，阐明了DNA甲基化在协调软骨细胞分化过程中能量供应与分化进程的精细调控作用。这不仅深化了我们对骨骼发育机制的理解，也为骨骼发育异常疾病和软骨相关疾病的治疗提供了新的思路和靶点。值得注意的是，能量代谢异常也与骨关节炎等年龄相关软骨疾病密切相关，因此该研究发现的机制可能具有更广泛的生理和病理意义。

研究也存在一些局限性，如未能阐明软骨细胞中DNA从头甲基化的作用，以及Dnmt1在关节软骨中的功能等。未来研究需要进一步探索Dnmt1表达在分化过程中的调控机制，以及Dnmt1介导的能量代谢改变是否与其他年龄相关病理过程相关。总体而言，这项研究为我们理解表观遗传如何通过代谢重编程调控细胞命运提供了重要见解。