机械感知GPCR LPHN2通过调控TMC1通道功能维持正常听觉的新机制

《Cell Reports》：The force-sensing GPCR LPHN2 is indispensable for normal auditory function

本研究针对听觉转导核心机制——机械电转导(MET)通道的调控难题，首次发现并证实了G蛋白偶联受体LPHN2在耳蜗毛细胞静纤毛尖端表达，能够直接感知机械力并通过与MET通道核心组分TMC1的相互作用调控其构象与活性。研究人员综合运用基因敲除小鼠模型、特异性抑制剂、单通道电生理记录及BRET等技术，揭示了LPHN2以Gs-cAMP非依赖的方式增强TMC1通道开放概率，从而促进毛细胞钙响应和谷氨酸释放，对维持正常听力至关重要。该研究不仅拓展了GPCR在快速感觉转导过程中的功能认知，也为理解听觉障碍的病理机制提供了新视角。

我们如何听到声音？这个看似简单的问题，实际上困扰了科学家数十年。在耳蜗深处，微小的毛细胞扮演着机械传感器的关键角色，它们顶部的静纤毛束能将声波振动转化为电信号——这个过程被称为机械电转导(MET)。虽然MET通道的核心组分TMC1/2等蛋白已被鉴定，但机械力如何被精确感知并调控通道活性的完整分子机制仍不清晰。

传统观点认为，G蛋白偶联受体(GPCR)因其信号转导相对缓慢，不太可能参与微秒级的听觉转导过程。然而，近年研究发现GPCR也能通过直接调控离子通道参与快速生理反应。那么，在听觉系统中，是否存在能够感知机械力并调控MET通道的GPCR呢？

针对这一科学问题，山东大学孙金鹏、徐志刚、于晓教授团队与东南大学柴人杰、河北大学王川教授等合作，在《Cell Reports》上发表了他们的最新发现。他们鉴定出黏附GPCR家族成员LPHN2(ADGRL2)在耳蜗毛细胞静纤毛尖端富集，并系统阐明了其作为机械力传感器调控听觉功能的关键作用及分子机制。

研究人员主要运用了条件性基因敲除技术(构建Pou4f3-CreER^+/-;Lphn2^fl/fl小鼠)、磁珠力施加系统、膜片钳电生理记录(包括单通道记录)、生物发光共振能量转移(BRET)技术、钙成像和谷氨酸传感器实时监测等关键技术方法。小鼠样本为课题组自行构建或由商业公司(Cyagen等)定制。

表达谱分析揭示LPHN2定位于毛细胞静纤毛

研究人员首先通过单细胞RNA测序数据和免疫荧光染色证实LPHN2在耳蜗内外毛细胞中均有表达，且定位于静纤毛较短排的顶端以及毛细胞的顶表面。利用转基因敲入小鼠(LPHN2^mCherry)进一步验证了这一特异性定位。

LPHN2缺失导致严重听力损伤

为了探究LPHN2的功能，研究团队构建了毛细胞特异性敲除LPHN2的小鼠模型(Pou4f3-CreER^+/-;Lphn2^fl/fl)。听觉脑干反应(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)检测结果显示，敲除鼠在所有测试频率下均表现出听力阈值显著升高，表明LPHN2对正常听觉功能不可或缺。值得注意的是，尽管听力严重受损，敲除鼠的毛细胞结构和MET通道组分的表达在P30时看起来正常，提示功能缺陷而非发育畸形。

LPHN2感知机械力并调控MET电流

通过膜片钳记录，研究发现Lphn2敲除毛细胞的MET电流幅度显著降低。为了进行可逆且特异的干预，团队通过虚拟筛选开发了一种LPHN2小分子抑制剂D11。有趣的是，在野生型毛细胞中，D11仅能抑制同时表达Lphn2和Tmc1的细胞亚群的MET电流，而对只表达Lphn2不表达Tmc1或两者都不表达的细胞无效，这提示LPHN2的功能依赖于TMC1。更重要的是，遗传敲除或药理抑制Gs蛋白并不影响D11对MET电流的抑制作用，表明LPHN2调控MET是一个Gs-cAMP非依赖的过程。

LPHN2与TMC1复合物存在物理与功能耦合

免疫共沉淀和质谱分析结果显示，LPHN2与MET通道关键组分TMC1、PCDH15等存在相互作用。为了在细胞模型中研究TMC1的功能，研究人员发现共表达VLGR1(另一种GPCR)能帮助TMC1定位到细胞膜上。在该重构系统中，施加作用于LPHN2的机械力可增加TMC1单通道的开放概率，此效应可被D11阻断，但不受Gs抑制剂影响。全细胞记录也证实，LPHN2能增强流体喷射刺激引发的TMC1电流。通过精巧设计的BRET构象传感器，研究团队观察到力作用于LPHN2可引起TMC1胞内环(ICL)发生特定运动，提示通道孔可能打开。

LPHN2力感知促进毛细胞钙响应与神经递质释放

功能上，利用基因编码的谷氨酸传感器(iGluSnFR)和钙指示剂(Fura-2)，研究发现敲除LPHN2或使用D11抑制其活性，均会显著减弱流体喷射或特异性磁珠力刺激引发的毛细胞谷氨酸释放和钙内流。这种LPHN2介导的效应完全依赖于完整的尖端连接(tip link)，因为使用BAPTA破坏尖端连接后，力刺激无法再引发钙信号和谷氨酸释放。相反，作用于尖端连接蛋白PCDH15的力刺激所诱导的cAMP产生，在Lphn2敲除毛细胞中显著降低，表明LPHN2与尖端连接在功能上相互依赖。

基因治疗恢复Lphn2缺陷小鼠听力

最后，研究人员通过圆窗膜注射AAV病毒，在Lphn2敲除鼠毛细胞中特异性重新表达LPHN2的GAIN结构域。这种干预成功将小鼠的ABR阈值、DPOAE以及MET电流恢复至接近正常水平，证明了靶向LPHN2的治疗潜力。

本研究结论与讨论部分指出，LPHN2的发现打破了GPCR不直接参与快速听觉转导的传统认知，揭示了一条全新的机械力感知与信号放大通路。LPHN2与TMC1、PCDH15等形成的复合物，可能作为一个整合性的机械转导单元，其中尖端连接既可通过LPHN2间接调控TMC1，也可能存在直接作用路径。LPHN2以一种不依赖于经典第二信使的、更直接的方式快速调控离子通道活性，这为理解GPCR的功能多样性提供了新范式。该研究不仅深化了对听觉分子机制的理解，也为感音神经性听力损失的诊断和治疗提供了新的潜在靶点。未来利用冷冻电镜等技术解析LPHN2-TMC1复合物的精细结构，将有助于揭示其工作机制的全貌。