数字化液滴PCR技术用于量化葡萄园土壤中Plasmopara viticola卵孢子的数量，并研究其在大范围空间上的分布情况

《Applied and Environmental Microbiology》：Digital droplet PCR quantification and field-scale spatial distribution of Plasmopara viticola oospores in vineyard soil

葡萄园霜霉病主要由疫霉菌Plasmopara viticola引起，其土壤越冬孢子是主要初侵染源。本研究开发了基于数字滴定PCR（ddPCR）的方法，定量分析了葡萄园土壤中该病原体的孢子浓度及空间分布。结果显示，土壤中孢子浓度范围为0-1858个/克，平均303个/克，存在15米直径的斑块状空间分布特征，且葡萄行下方（ ridge）的孢子浓度比间行高5-6倍。通过叶盘生物测定验证，孢子浓度与感染潜力呈正相关（R2=0.33），但DNA定量方法存在效率波动和低估问题。研究提出需结合环境因素和改进检测方法以提高评估准确性，为可持续植保策略提供依据。

### 葡萄霜霉病的土壤病原体储备研究

葡萄霜霉病是由卵菌（oomycete）*Plasmopara viticola*引起的，对全球葡萄种植业造成严重威胁。这种病害通常会影响叶片和果实，导致显著的经济损失。传统的防治手段主要依赖于化学杀菌剂的使用，但这些化学物质对环境和生态系统的潜在危害日益受到关注。因此，研究如何在不依赖化学杀菌剂的情况下有效管理葡萄霜霉病成为一个重要课题。

在葡萄园土壤中，*P. viticola*的初级病原体（即卵孢子）在病害爆发中起着决定性作用。然而，我们对这些卵孢子在土壤中的数量和空间分布仍知之甚少。本研究采用了一种新颖的分子方法，利用数字滴定PCR（ddPCR）技术对葡萄园土壤中的卵孢子浓度进行定量分析。这一方法不仅有助于理解初级病原体的分布模式，还为不同农业气候条件下的病害防控策略提供了重要依据。

#### 研究背景与意义

近年来，人们逐渐认识到土壤中的卵孢子在葡萄霜霉病传播过程中的重要性。虽然目前的防治策略仍以化学杀菌剂为主，但这些手段对环境的污染和对生物多样性的威胁已引起广泛关注。在欧洲，特别是法国，政策正在鼓励减少化学农药的使用，例如通过改进使用效率或开发替代的病害管理方案。这表明，探索非化学手段来管理葡萄霜霉病具有重要的现实意义。

本研究的意义在于，提出了一种直接且敏感的方法来评估土壤中的卵孢子浓度，并提供了关于葡萄霜霉病初级病原体的定量和空间分布数据。这一方法为新的研究方向提供了基础，包括对基于初级病原体管理的病害防控策略进行评估，以及改进病害风险预测模型。这些数据有望帮助减少化学杀菌剂的使用，从而推动更可持续的葡萄种植实践。

#### 研究方法与实施

本研究在法国波尔多地区的INRAE Bordeaux Nouvelle-Aquitaine研究中心进行，针对一个种植了梅洛（Merlot）品种葡萄的0.22公顷实验葡萄园。该葡萄园按照法国有机葡萄种植规范进行管理，允许使用波尔多混合液（含铜）作为唯一的化学杀菌剂。研究团队在2022年3月采集了198个土壤样本，覆盖整个葡萄园，形成一个2.85×3.2米的正交网格。此外，还在五个嵌套采样区域中进行了更细致的采样，包括在葡萄行之间（inter-rows）的采样。

为了评估土壤中卵孢子的浓度，研究团队使用ddPCR技术对*P. viticola*的DNA进行定量分析。ddPCR是一种能够直接绝对量化DNA的技术，特别适用于复杂基质中罕见目标的检测。这种方法能够提供更高的灵敏度和更准确的定量结果。此外，研究团队还设计了一种生物测定方法，用于评估土壤的感染潜力。通过将土壤样本置于适宜的温度和湿度条件下，观察释放的游动孢子对葡萄叶片的感染情况，从而间接评估土壤中的卵孢子数量。

#### 研究结果与分析

在采集的198个土壤样本中，除了一个样本外，其余均检测到了*P. viticola*的DNA。平均卵孢子浓度为303±308个/克土壤，范围从0到1858个/克土壤。研究发现，卵孢子在田间并非随机分布，而是呈现出以15米为直径的同心圆状分布模式，即在靠近葡萄植株的区域卵孢子浓度更高。进一步分析显示，卵孢子在葡萄植株下方的土壤中积累的量是行间土壤的五倍。

生物测定结果显示，土壤中的卵孢子数量与感染潜力之间存在显著的正相关关系。然而，这种关系的决定系数较低，表明基于DNA的卵孢子量化方法在病害流行学中的重要性仍需进一步验证。尽管如此，这两种方法（ddPCR和生物测定）仍然具有重要的应用价值，可以用于评估不同农业环境下的病原体储备，并为制定更有效的病害管理策略提供支持。

#### 空间结构分析

通过空间统计方法，研究团队分析了*P. viticola*初级病原体在田间和采样区域内的空间分布。研究发现，卵孢子的分布呈现出一定的空间结构，即在田间形成了15米直径的同心圆状分布。这种分布模式可能与病原体的传播方式、环境因素（如风力、湿度）以及葡萄园的管理实践有关。

在行间采样点中，卵孢子的浓度较低，而在葡萄植株下方的土壤中浓度显著升高。这一结果与葡萄叶的落叶模式和土壤管理实践密切相关。例如，葡萄园中土壤的翻耕和管理措施可能影响卵孢子的分布。此外，研究还发现，不同行之间的卵孢子浓度存在差异，特别是最西侧的行，其卵孢子浓度显著低于其他行。这可能与相邻的树篱（shrubby hedgerow）有关，这些树篱可能影响风力和微气候，从而改变病原体的传播和积累。

#### 病原体存活与感染潜力

研究还探讨了卵孢子在土壤中的存活情况及其对病害传播的潜在影响。通过生物测定方法，研究团队评估了土壤样本的感染潜力。结果表明，卵孢子的浓度与感染率之间存在正相关关系，但相关性较弱，这可能与卵孢子的存活时间、环境条件以及DNA检测方法的局限性有关。

卵孢子能够在土壤中存活至少五年，并且在不同季节的感染时间和速率可能受到环境条件的影响。因此，单一时间点的生物测定可能无法全面反映卵孢子的感染潜力。此外，卵孢子的年龄结构也可能影响其感染能力，不同年龄段的卵孢子可能具有不同的萌发效率。

#### 未来研究方向与应用

本研究的结果为未来的病害管理策略提供了重要参考。首先，需要进一步优化基于DNA的卵孢子量化方法，以提高其准确性和可靠性。这包括减少技术误差、提高DNA提取的效率以及考虑土壤中非活性DNA的干扰。其次，应探索卵孢子在不同环境条件下的萌发机制，以及其与病害爆发之间的关系。

此外，研究还建议，在葡萄园中采用更环保的病害管理措施，例如通过减少卵孢子的积累、改善土壤管理实践和利用生物解决方案来防止病原体的繁殖和存活。这些措施可以有效降低病害的发生风险，并减少对化学杀菌剂的依赖。

#### 结论

本研究通过ddPCR技术首次对葡萄园土壤中的*P. viticola*卵孢子浓度进行了定量分析，并揭示了其在田间的空间分布模式。研究结果表明，卵孢子在葡萄植株下方的土壤中积累较多，且其浓度与病害的感染潜力存在一定的关联。尽管基于DNA的量化方法仍存在一定局限性，但其在病害流行学研究和病害管理策略制定中的价值不容忽视。

未来的研究应进一步探讨卵孢子的年龄结构、环境条件对其萌发的影响，以及如何通过改进土壤管理实践来减少病原体的积累。此外，还需要在不同葡萄园和不同气候条件下验证这些方法的适用性，以实现更广泛的推广和应用。最终，这些数据将为制定更精确的病害风险模型和评估新的病害防控策略提供支持，有助于推动葡萄种植业向更加可持续的方向发展。