利用杂合启动子转录靶向系统性递送溶瘤腺病毒攻克肿瘤异质性

《Molecular Therapy Oncology》：Tackling cancer heterogeneity with systemically delivered oncolytic adenoviruses transcriptionally targeted with hybrid promoters

本研究针对肿瘤异质性导致的治疗抵抗难题，开发了由A33和vWA2启动子杂合构建的hTSP驱动的新型溶瘤腺病毒AR2015。实验证明AR2015能有效靶向不同抗原表达的结直肠癌细胞，在体内外均展示出显著抗肿瘤活性，且与奥沙利铂联用可进一步增强疗效，为克服肿瘤异质性提供了新策略。

癌症治疗领域正面临着一个严峻挑战：肿瘤异质性。就像一片森林中找不到两片完全相同的叶子，同一个肿瘤内部也存在着千差万别的癌细胞群体。这种多样性使得针对单一靶点的精准治疗往往只能消灭部分癌细胞，而其他细胞亚群则可能幸存下来，最终导致治疗抵抗和疾病复发。

在结直肠癌(CRC)治疗中，这一挑战尤为突出。尽管靶向癌症基因中可操作改变的策略已经改变了癌症治疗模式，但抗肿瘤反应在不同癌症类型中并不一致。更棘手的是，随着实体肿瘤的进化，它们会产生表达去抑制或突变抗原的亚克隆，进一步增加了治疗策略的复杂性。转移扩散则引入了另一层困难，因为转移灶间和转移灶内的异质性都会导致治疗抵抗。

在这一背景下，工程化溶瘤病毒(OVs)作为一种有前景的癌症治疗策略应运而生。溶瘤腺病毒(OAds)可以通过转录靶向实现在癌细胞中的选择性复制，这种选择性是通过用肿瘤特异性启动子(TSPs)替换控制腺病毒复制的E1A基因的天然启动子来实现的。然而，肿瘤异质性仍然是一个关键挑战。缺乏特定启动子活性所需的细胞可能逃逸感染，最终形成耐药转移灶。

为了解决这一难题，阿根廷Leloir研究所的Osvaldo L. Podhajcer和Eduardo G. A. Cafferata领导的研究团队开展了一项创新性研究，开发了一种能有效应对肿瘤异质性的新型溶瘤病毒。他们的研究成果发表在《Molecular Therapy Oncology》上，为克服肿瘤治疗抵抗提供了新思路。

研究人员采用的主要技术方法包括：通过DisGeNET和TCGA数据库进行生物信息学分析筛选候选基因；利用荧光素酶报告基因检测评估启动子活性；构建由杂合启动子驱动的溶瘤腺病毒AR2015；通过体外细胞毒性实验和体内裸鼠肝转移模型评估病毒疗效；使用患者来源异种移植(PDX)模型验证临床相关性。

选择A33和vWA2构建hTSP

研究人员首先通过全面的生物信息学分析，从6,254个与CRC进展相关的基因中筛选出适合构建杂合启动子(hTSP)的候选基因。通过比较DisGeNET和TCGA数据库，他们获得了4,488个共享基因，进一步分析后最终确定了A33和vWA2作为最优候选基因。实验显示，A33在早期CRC中上调而在晚期下调，vWA2则呈现相反趋势，这种互补表达模式使其成为应对肿瘤异性的理想靶点。

hTSP的构建和转录活性评估

研究团队通过计算机分析确定了vWA2启动子的关键区域，克隆了一个636 bp的片段，并进一步筛选出一个306 bp的转录沉默片段。同时，他们鉴定了一个412 bp的A33启动子片段，包含肠道上皮相关调控元件。将这两个片段组合构建了名为vWA33-hTSP的杂合启动子。荧光素酶报告实验证明，这种杂合启动子在所有测试的CRC细胞系中都具有转录活性，包括不表达A33的HCT116细胞。

AR2015对人CRC细胞具有高度特异性裂解活性

基于上述发现，研究人员构建了新型溶瘤腺病毒AR2015，其中E1A表达由vWA33-hTSP杂合启动子驱动。与由单一启动子驱动的对照病毒相比，AR2015在所有测试的CRC细胞系中都表现出裂解活性，包括对单一启动子病毒耐药的细胞系。重要的是，AR2015对非恶性人类结肠上皮细胞(CCD841)等其他正常细胞没有裂解作用，证实了其高度的CRC特异性。

系统性给药的AR2015在CRC肝转移临床前模型中具有高效力

在模拟播散性疾病的实验中，研究人员通过脾内注射HCT116细胞建立了CRC肝转移模型。系统性给予AR2015能显著抑制肝转移灶的生长，而由单一A33启动子驱动的AV22EL在此模型中无效。在独立实验中，AR2015也显示出优于由vWA2启动子驱动的AV636的疗效。

AR2015与OXA联用显示体内效力并在人PDX来源肿瘤细胞中具有体外裂解活性

在进一步的实验中，研究人员使用LoVo细胞建立了另一个CRC肝转移模型，并研究了AR2015与奥沙利铂(OXA)联用的效果。结果显示，AR2015与低剂量OXA联用能进一步增强抗肿瘤效果。此外，在患者来源异种移植(PDX)模型中的实验也证实了AR2015对患者来源的CRC细胞具有高效裂解活性。

研究结论和讨论部分强调，这项研究证明由杂合启动子驱动的转录靶向溶瘤腺病毒能有效对抗异质性癌细胞群体。AR2015在缺乏内源性A33表达的HCT116细胞中有效复制，并在系统性给药后对不同肿瘤模型中的 established 转移性肝病灶表现出显著的体内抗肿瘤活性。与标准护理化疗药物OXA联用可进一步增强其抗肿瘤活性。

这种策略的重要性在于，系统性给予由杂合启动子调控的转录靶向溶瘤腺病毒，能够识别和选择性破坏表达不同抗原的更广泛癌细胞群体。这一方法可成功应用于治疗以肿瘤抗原异质性表达为特征的播散性疾病。此外，hTSP转录靶向溶瘤腺病毒能促进转移部位肿瘤新抗原的释放，可能引发针对与原发灶不同的肿瘤抗原的免疫反应。

该研究为应对肿瘤异质性提供了一种创新性策略，通过合理设计的杂合启动子扩展了溶瘤病毒的治疗谱，为提高癌症治疗效果特别是针对转移性疾病开辟了新途径。未来研究将探索构建三重或四重杂合启动子的可行性，以进一步增强溶瘤腺病毒的抗肿瘤效力和选择性。