基于接枝和双配体系统的疏水电荷诱导色谱选择性逐步增强策略研究

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Stepwise enhancement of selectivity in hydrophobic charge-induction chromatography through grafted and dual-ligand systems

本研究针对复杂原料中蛋白质治疗剂分离选择性低的难题，通过构建接枝单配体(4FF-G-S)和接枝双配体(4FF-G-D)系统，实现了疏水电荷诱导色谱(HCIC)选择性的显著提升。实验表明，在pH 7.0无盐条件下，选择性因子(α=QbIgG/QBSA)从1.5逐步提高至3.7和6.8，bIgG回收率从69.5%提升至92.7%，为生物制药过程中精确蛋白质纯化提供了创新解决方案。

在生物制药领域，蛋白质类药物如单克隆抗体、治疗性酶和重组蛋白因其高特异性和疗效已成为现代药物开发的重要方向。然而，从复杂原料中分离这些生物大分子始终是生物加工过程中的主要瓶颈。蛋白质混合物在大小、结构和理化性质上存在显著差异，使得分离过程复杂化，并增加了污染和生物活性丧失的风险。传统色谱技术虽然广泛应用于蛋白质纯化，但在处理具有竞争性吸附的蛋白质时，往往缺乏足够的立体特异性选择性，导致分辨率低和非特异性结合等问题。

针对这一挑战，研究人员在《Biochemical and Biophysical Research Communications》上发表了一项创新研究，通过逐步策略增强疏水电荷诱导色谱(Hydrophobic Charge-Induction Chromatography, HCIC)的选择性。HCIC作为一种混合模式色谱，独特地结合了疏水相互作用和静电效应，通过pH依赖性吸附和解吸实现温和洗脱，能有效保持目标分子的结构和活性。然而，传统HCIC中配体主要以平面方式分布在树脂表面和孔道中，对具有复杂构象的蛋白质缺乏足够的立体选择性。

本研究提出了一种两步修饰策略：第一阶段引入接枝聚合物层（接枝单配体系统），第二阶段在接枝基础上结合第二种配体（接枝双配体系统）。研究人员选用了2-(氨甲基)吡啶和4-(1H-咪唑-1-基)苯胺作为配体，以牛免疫球蛋白G(bIgG)和牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白质，系统比较了未接枝单配体(4FF-S)、接枝单配体(4FF-G-S)和接枝双配体(4FF-G-D)三种树脂的性能。

关键技术方法包括：通过原子转移自由基聚合(ATRP)制备接枝聚合物层，利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)和扫描电子显微镜(SEM)表征树脂结构，采用静态吸附、吸附动力学、穿透实验和血清分离实验评估树脂性能。研究系统考察了pH值、盐浓度和流速等环境因素的影响。

【材料表征】

通过傅里叶变换红外光谱分析发现，所有树脂在3670-3180 cm^-1处均显示羟基的O-H伸缩振动特征峰。接枝改性后的树脂在1730 cm^-1处出现羰基特征峰，1595 cm^-1和1520 cm^-1处出现吡啶环和咪唑环的特征吸收峰，证实了配体的成功接枝。扫描电子显微镜显示接枝后树脂表面形貌发生明显变化，孔径分布分析表明4FF-S120、4FF-G130-S250和4FF-G130-D250+140的平均孔径分别为13.1 nm、20.5 nm和19.8 nm，接枝过程有效扩大了树脂的孔径。

【吸附性能研究】

静态吸附实验显示，在最佳条件（pH 7.0，无盐）下，三种树脂对bIgG和BSA的选择性因子(α)呈现显著差异：4FF-S为1.5，4FF-G-S提高至3.7，4FF-G-D进一步提升至6.8，相对于基线分别改善了146%和353%。吸附动力学研究表明，接枝单配体树脂显著增强了bIgG的优先结合能力，而双配体设计通过协同多位点相互作用进一步放大了选择性。相应的，bIgG回收率从69.5%提高到85.5%和92.7%，表明改性策略有效提升了目标蛋白的回收效率。

【动态分离性能】

穿透实验证实，接枝和双配体系统在动态条件下仍保持优异的选择性。在血清分离实验中，接枝双配体树脂展现出对bIgG的特异性吸附能力，能有效从复杂蛋白质混合物中分离目标蛋白。环境因素研究表明，pH值对吸附选择性影响显著，中性条件最有利于选择性吸附，而盐浓度的增加会降低选择性，这符合HCIC的作用机制。

【结论与讨论】

本研究通过逐步增强策略成功提升了HCIC的选择性性能。接枝聚合物层的引入不仅增加了可及结合区域，还改变了孔道几何结构，为蛋白质提供了更有利的结合环境。双配体系统的构建则通过协同多位点、多模式相互作用，进一步增强了树脂对目标蛋白的识别能力。这种组合策略有效解决了传统色谱在分离大小和构象差异蛋白质时选择性不足的问题。

该研究的创新之处在于将选择性优化问题转化为工程机遇，通过可实施的修饰步骤（接枝和配体组合）实现了可测量的、渐进的选择性增益。接枝和双配体系统在动态条件下表现出高效和选择性，为生物制药过程中精确蛋白质纯化提供了实用且可扩展的途径。这一策略不仅适用于HCIC平台，还可推广到其他色谱技术，为复杂生物分子的高效分离提供了新思路。

研究成果对生物制药行业具有重要实践意义，特别是在治疗性抗体和重组蛋白的纯化工艺开发方面。通过提高分离选择性和回收率，这一技术有望降低生产成本，提高产品质量，满足日益增长的生物制药市场需求。未来的研究可进一步探索不同配体组合和接枝策略，以拓展该方法在更多生物分离场景中的应用。