利用先进的遗传标记技术开发荧光标记的Fusarium oxysporum f. sp. lini菌株及其致病性评估

《CELLULAR MICROBIOLOGY》：Development of a Fluorescently Tagged Fusarium oxysporum f. sp. lini Strain Using Advanced Genetic Labeling and Its Pathogenicity Assessment

本研究通过农杆菌介导转化成功构建了表达GFP和dsRed荧光标记的尖孢镰刀菌fl亚种lini转株。验证了转株致病性与野生型一致，并优化了转化条件。建立的荧光标记系统可实时追踪真菌侵染过程，为解析植物-病原菌互作机制提供工具。

　　在这项研究中，科学家们致力于开发一种能够表达荧光蛋白的转基因株，用于研究植物与真菌之间的相互作用。这种相互作用对于理解作物病害机制至关重要，特别是在对大麻（*Linum usitatissimum*）的感染过程进行可视化研究方面。*Fusarium oxysporum* f. sp. *lini*（简称Foln）是一种重要的病原菌，它能够引起大麻的枯萎病，导致约20%的产量损失。为了更好地研究其病害过程，科学家们利用了*Agrobacterium*介导的转化技术，将绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（dsRed）基因引入Foln中，以提高感染过程的可视性。

研究首先通过*Agrobacterium*转化方法，制备了多个携带荧光标记的转基因菌株。通过比较不同*Agrobacterium*菌株的转化效率，科学家们筛选出具有最佳转化效果的菌株。转化后的菌株通过表型特征进行初步筛选，并进一步使用分子生物学技术进行验证。为了确保转基因菌株的病原性不受影响，科学家们对感染过程中的病原相关基因和活性氧（ROS）代谢相关基因的表达水平进行了分析，并通过测量感染植物组织中的ROS水平，如超氧自由基（O??）和过氧化氢（H?O?）来评估病原性。通过荧光显微镜对dsRed和GFP标记的表达进行了确认，最终筛选出两个与野生型Foln在病原性方面相似的转基因菌株。

研究发现，不同*Agrobacterium*菌株的转化效率存在差异。例如，AGL1和EH105菌株在Foln转化中表现出较高的效率，而LBA4404和C58菌株则未能成功生成转基因菌株。此外，转基因菌株在培养过程中可能出现标记基因丢失的现象，因此需要通过多次重复实验来验证其稳定性。科学家们还发现，使用不同的细菌与孢子比例会影响转化效率，部分菌株在特定比例下表现出更高的转化率。

在植物感染和组织采集方面，科学家们使用了大麻种子，并在无菌条件下进行培养。感染后的植物组织（如茎和根）被采集并冷冻保存，以进行后续的分子分析。通过检测ROS水平和相关基因的表达，科学家们评估了植物的免疫反应是否与野生型Foln感染时相似。实验结果表明，转基因菌株在感染过程中能够引发与野生型菌株类似的ROS代谢反应，这有助于进一步研究病原菌与宿主之间的相互作用。

此外，研究还探讨了不同培养条件对转化效率的影响，包括培养时间、培养温度、过滤材料等。科学家们发现，使用不同的培养条件能够显著提高转化率，例如，延长培养时间或使用不同的过滤材料。这些结果为未来研究其他*F. oxysporum*病原菌株的转基因技术提供了重要的参考。

研究的最终目的是开发一种能够在大麻中实现可视化感染过程的转基因工具，以更直观地观察病原菌在植物体内的传播路径。通过使用荧光显微镜，科学家们能够快速识别转基因菌株的感染过程，而无需进行复杂的化学染色。这不仅提高了研究效率，也增强了对植物防御机制的理解。

总之，这项研究通过转基因技术成功地开发了能够表达荧光蛋白的Foln菌株，并评估了它们的病原性和表型特征。这些菌株不仅能够帮助科学家更深入地研究Foln与大麻之间的相互作用，还为其他*F. oxysporum*病原菌株的转基因研究提供了可借鉴的流程。研究结果表明，选择合适的*Agrobacterium*菌株和培养条件是提高转化效率的关键因素，同时还需要对转基因菌株的稳定性进行持续监测。未来的研究将进一步优化这些条件，并探索更多关于病原菌与宿主之间相互作用的细节，为防治大麻枯萎病提供科学依据。