ODR1/AtSDR4L通过ABA依赖性负反馈调控渗透胁迫诱导的种子萌发抑制新机制

《BMC Plant Biology》：ODR1/AtSDR4L alleviates osmotic stress-induced germination arrest via ABA-dependent negative feedback on ABA biosynthesis

本研究针对植物如何平衡生存与萌发以应对多变环境这一关键科学问题，聚焦ODR1/AtSDR4L基因在渗透胁迫下种子萌发调控中的作用。研究人员通过遗传学、分子生物学及转录组学等方法，发现ODR1受渗透胁迫通过ABA依赖性途径诱导表达，进而通过抑制ABA生物合成基因（如ABA1）的表达来限制ABA过度积累，从而缓解渗透胁迫诱导的萌发停滞。该研究揭示了ODR1在种子休眠建立和胁迫萌发响应中均通过ABA依赖性负反馈调控ABA生物合成的核心作用，为理解植物协调萌发时序的分子机制提供了新见解，对作物抗逆育种具有重要理论意义。

　　

在大自然的生存竞赛中，种子植物演化出了精妙的策略来优化后代生存机会：种子休眠帮助它们避免在短暂适宜窗口中“全军出击”式同步萌发，而萌发“刹车”机制则让已经开始萌发的种子在感知到胁迫信号时能够紧急暂停，从而规避潜在伤害。这两种策略虽然作用于不同发育阶段，但都通过精确控制萌发时机来提升后代在多变环境中的韧性。然而，一个核心谜团始终困扰着科学家：植物如何整合这些策略，在不同阶段协调萌发时序？

脱落酸（ABA）作为这两种过程中的核心调控因子，其内源水平的动态波动精确调控着种子的萌发潜力。在种子发育过程中，ABA逐渐积累以诱导和维持休眠；而在萌发早期，其水平急剧下降。当种子在此阶段感知到渗透胁迫等压力时，会迅速诱导ABA的重新积累，充当“刹车”延迟或停止萌发。这种动态积累模式使ABA成为整合这两种适应性策略的核心分子枢纽，但调控这种波动的分子网络仍不清楚。

此前，研究人员鉴定出ODR1（REVERSAL OF RDO5 1）作为一个重要的种子休眠调控因子，它通过抑制bHLH57依赖性转录激活ABA生物合成基因NCED6/9来负向调控种子休眠。然而，ODR1在胁迫条件下的种子萌发中是否发挥作用仍是未知数。这项发表在《BMC Plant Biology》的研究，揭开了ODR1在渗透胁迫诱导的萌发停滞中的新角色，为理解植物如何微调ABA信号以平衡生存与萌发提供了关键答案。

为了开展研究，作者团队运用了多项关键技术。遗传材料上，使用了ODR1功能缺失突变体（odr1-2, odr1-3, odr1-5）、ABA生物合成缺陷突变体nced6/9以及ABA信号突变体（abi3-1, abi4-t, abi5-8），并构建了ODR1回补株系。表型分析主要通过种子萌发和休眠实验，在不同浓度甘露醇（模拟渗透胁迫）和氟啶酮（ABA生物合成抑制剂）处理下进行。分子机制探索依赖定量实时PCR（qRT-PCR）分析基因表达，RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析，并重新分析了已发表的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据验证蛋白与DNA结合。此外，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）平台测定了种子内ABA含量。

Loss of ODR1 function arrests seed germination under osmotic stress

研究发现，在正常条件下，odr1突变体与野生型Col-0的种子萌发无显著差异。然而，在甘露醇模拟的渗透胁迫下，odr1突变体表现出明显的萌发停滞。在200 mM甘露醇处理下，大部分Col-0种子能发育至子叶变绿阶段（萌发后生长阶段），而约一半的odr1突变体种子仍停留在胚根突破种皮阶段（萌发完成阶段）。当甘露醇浓度增至300 mM时，部分Col-0种子仍能完成萌发，而odr1突变体种子几乎无法萌发。统计分析表明，在200 mM和300 mM甘露醇条件下，两种odr1突变体种子的胚根突破率和子叶变绿率均显著低于Col-0。动态追踪显示，在含100或200 mM甘露醇的平板上，odr1突变体的萌发速率早在第2天就开始与Col-0显著分离。在Ler背景的odr1-5突变体中也观察到类似的萌发减弱表型。这些结果提示ODR1可能参与促进种子在渗透胁迫条件下的萌发。

ODR1 complementation lines rescues the seed germination arrest of odr1-2 mutants under osmotic stress

为了验证ODR1的功能，研究人员在odr1-2突变体背景下，利用种子特异性12S启动子驱动ODR1编码序列（CDS）表达，构建了回补株系。qRT-PCR证实ODR1在回补株系发育种子中的表达显著恢复，并且odr1-2增强的种子休眠表型也被完全挽救。萌发实验显示，在不同浓度甘露醇处理下，所选的回补株系（ODR1_Com#8, #11, #23）的萌发率均显著高于odr1-2，甚至达到或接近Col-0水平。即使在300 mM高渗胁迫下，这些回补株系也能像Col-0一样进展到子叶变绿阶段。这表明种子特异性表达ODR1能挽救odr1-2种子在渗透胁迫下的萌发停滞，证实ODR1在渗透胁迫条件下的种子萌发中起正向调控作用。

Osmotic stress induces and maintains during seed germination

对公共转录组数据的分析发现，在正常条件下，种子萌发过程中ODR1表达在层积处理后急剧下降，并在后续萌发过程中持续降低，至48小时几乎检测不到。然而，渗透胁迫（300 mM甘露醇处理48小时）能显著上调ODR1表达近30倍。短期处理动力学分析进一步证实，在无甘露醇条件下，ODR1表达在吸胀后3小时即显著下降，48小时降至极低水平；而在甘露醇处理下，ODR1表达在整个时间过程中均维持在相对较高水平。这表明渗透胁迫在种子萌发过程中诱导并维持了ODR1的高表达，使其能在渗透胁迫下有效促进种子萌发。

P<0.05 andP<0.01 indicate signifi-cant differences compared with the 0 mM mannitol control.D Kinetics of ODR1 expression in response to mannitol treatment. Col-0 seeds were treated as described in(C).RNA was extracted from seeds sampled at specified time intervals.UBC21 was used as an internal reference gene. Data represent three PCR analysis of ODR1 expression in response to mannitol treatment. Col-0 seeds were sown on 1/2 MS plates with 0 mM(Mock) or 300 mM mannitol,using a two-tailed Student's t-test.P<0.05 and**P<0.01 indicate significant differences compared with the 0 h control'>

Osmotic stress induces ODR1 expression through an ABA-dependent pathway

由于渗透胁迫会诱导ABA积累并激活ABA信号通路，且ODR1表达可被ABA强烈诱导，研究人员探究了渗透胁迫诱导的ODR1表达是否依赖于ABA。在ABA生物合成缺陷突变体nced6/9中，甘露醇诱导的ODR1表达上调显著减弱。即使在无胁迫条件下，nced6/9中ODR1的基础表达水平也显著低于Col-0。在ABA信号突变体中，abi3-1的ODR1表达变化无统计学显著性，而abi4-t和abi5-8突变体中的ODR1表达在有无甘露醇处理下均比Col-0降低至少三分之一。这些结果表明，渗透胁迫诱导的ODR1表达是ABA依赖性的：ABA积累提供了基础的诱导信号，而ABA响应转录因子如ABI4和ABI5则协同介导了ODR1在渗透胁迫下的稳健诱导。

ODR1 represses the expression of ABA metabolic genes during seed germination under osmotic stress

鉴于ODR1在渗透胁迫下的表达是ABA依赖性的，且其通常作为转录抑制子发挥作用，研究人员通过转录组分析比较了Col-0和odr1-2种子在胁迫和非胁迫条件下核心ABA代谢基因的表达。结果显示，在18个关键ABA代谢基因中，有7个在至少一种条件下在odr1-2中表达显著差异，且全部为上调。此外，另有两个ABA生物合成基因（NCED1和NCED4）表达差异也达到统计显著水平（P < 0.05）。值得注意的是，这9个基因中有8个（88.89%）参与ABA生物合成，占所分析12个ABA生物合成基因的66.7%，提示ODR1优先抑制ABA生物合成基因。根据萌发阶段表达水平，ABA1、NCED1和CYP707A2被确定为主要候选靶点。对已发表ODR1 ChIP-seq数据的重新分析显示，在ABA1启动子区检测到明显的ODR1结合峰，而在NCED1和CYP707A2等位点的结合信号则不一致或缺失。qRT-PCR验证表明，ODR1回补株系能显著挽救odr1-2中ABA1的上调表达。这些结果将ODR1的转录抑制活性与其在渗透胁迫下种子萌发过程中抑制ABA合成基因表达的功能联系起来。

P<0.05 andP<0.01 indicate significant differences compared with Col-0.ChIP-seq analysis of ODR1 binding to ABA1 genes.Raw ChIP-seq data were retrieved from previous studies[56, 58] and visualized using IGV(Integrative Genomics Viewer). Solid arrows indicate ODR1 binding peaks, while open arrows mark positions corresponding to these peaks where no binding was detectable.D qRT-PCR analysis of rescued ABA1 expression in ODR1 complementation lines.Col-0,odr1-2,and ODR1 complementation line seeds were treated as described in(A). RNA was extracted from seeds after 12 h of treatment. UBC21 was used as an internal reference gene. Data represent three biological replicates(mean±SD).The average relative expression level of ABA1 in Col-0 seeds was normalized to 1. Statistical significance was determined using a two-tailed Student's t-test.P<0.05 and*P<0.01 indicate significant differences compared with Col-0'>

ODR1 alleviates osmotic stress-induced germination arrest via repressing ABA accumulation

ABA含量测定显示，在吸胀后24小时，无论有无胁迫，odr1-2种子中的ABA水平均显著高于Col-0，这与ABA生物合成基因的上调一致。尽管ABA分解代谢基因CYP707A2在odr1-2中也显著上调，但这可能是对ABA水平升高的反馈调节反应。为了验证odr1在渗透胁迫下的萌发停滞是否由过量ABA积累引起，研究人员评估了odr1突变体与Col-0种子在含300 mM甘露醇和不同浓度氟啶酮（ABA生物合成抑制剂）的培养基上的萌发情况。氟啶酮能缓解甘露醇对Col-0萌发的抑制，并且对odr1突变体表现出更显著的挽救效应。这证实odr1突变体在渗透胁迫下的萌发停滞确实归因于过量的ABA积累，表明ODR1通过抑制ABA积累来缓解渗透胁迫诱导的萌发停滞。

P<0.05 andP<0.01 indicate significant differences compared with Col-0.B Statistical analysis of seed germination rates of Col-0,odr1-2,and odr1-3 under osmotic stress and fluridone treatments. Seeds were sown on 1/2 MS plates supplemented with 0 or 300 mM mannitol and various concentrations of fluridone, stratified at 4°C for 3 days, and then transferred to a growth chamber.Germination(defined as radicle emergence) was evaluated at 5 DAS.Data represent three biological replicates(mean±SD). Statistical significance was determined using a two-tailed Student's t-test.P<0.05 and**P<0.01 indicate significant differences compared with Col-0.Flu,fluridone;Man,mannitol.CGermination phenotypes of Col-0,odr1-2,and odr1-3 under osmotic stress and fluridone treatments. Seeds were treated as described in(B).Images of germination were captured using a camera at 5 DAS.Scale bar=1 cm.Flu,fluridone;Man,mannitol'>

综上所述，本研究揭示了ODR1在渗透胁迫下种子萌发中的关键作用。ODR1响应ABA信号，同时反馈抑制ABA生物合成，从而形成一个负反馈循环，防止ABA过度积累。通过平衡ABA信号与代谢，ODR1使种子能够在逆境条件下实现适应性萌发。该研究将ODR1定位为种子萌发时序的核心协调者，其在休眠建立和渗透胁迫响应中均通过ABA依赖性负反馈调控ABA生物合成。这一机制解答了植物如何微调ABA信号以在多变环境中平衡生存与萌发这一关键问题。

值得注意的是，ODR1是水稻休眠基因Sdr4的同源物，但二者对种子休眠的调控效应相反，反映了其在植物休眠调控中功能既保守又分化。阐明Sdr4是否调控水稻种子对渗透胁迫的响应，对于理解同源基因的跨物种进化以及为水稻育种提供分子靶标具有重要的实践意义。此外，ODR1可能还整合了其他调控途径（如赤霉素通路）来精细调控种子萌发，这为未来的研究提供了新的方向。总之，这项研究不仅深化了我们对植物整合胁迫信号与激素稳态的理解，也为增强作物抗穗发芽和渗透胁迫能力提供了潜在的分子靶点。