转录因子ZEB2通过调控CD8+T细胞分化增强非小细胞肺癌中肿瘤浸润淋巴细胞的抗肿瘤功效

《Cell Death & Disease》：The transcription factor ZEB2 mediates the antitumor efficacy of tumor-infiltrating lymphocytes in non–small cell lung cancer

本研究针对非小细胞肺癌（NSCLC）患者对免疫检查点阻断（ICB）疗法应答率低的临床难题，通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析发现转录因子ZEB2是驱动CD8+T细胞向细胞毒性效应细胞（Teff）分化的关键调控因子。研究人员证实ZEB2在T-bet下游发挥作用，并通过动物实验证明T-bet/ZEB2轴不仅能独立于ICB发挥抗肿瘤作用，还是IL-2+IL-12联合免疫疗法的关键介质。该研究为改善NSCLC免疫治疗效果提供了新的靶点和策略。

　　

在非小细胞肺癌治疗领域，免疫检查点阻断疗法虽然为晚期患者带来了希望，但相当大比例的患者会出现治疗抵抗和复发。问题的核心在于肿瘤微环境中CD8⁺肿瘤浸润淋巴细胞（CD8⁺ TILs）的功能失调，这些细胞失去了产生干扰素-γ（IFN-γ）和发挥细胞毒性的能力。因此，寻找能够促进功能性效应T细胞（Teff）分化的关键调控因子，成为提高免疫治疗效果的关键突破口。

针对这一挑战，Jiajia Wang等研究人员在《Cell Death and Disease》上发表了重要研究成果。他们通过对14例初治NSCLC患者的深度单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据进行分析，发现转录因子ZEB2可能是驱动CD8⁺T细胞向细胞毒性效应轨迹分化的关键调控因子。

研究人员首先通过metaVIPER算法分析单细胞数据，构建了不同CD8⁺T细胞亚群的基因调控网络。分析结果显示，ZEB2与TBX21（T-bet）和PRDM1（Blimp-1）共同构成了细胞毒性效应分支的核心调控网络。特别值得注意的是，ZEB2的转录活性在效应细胞中显著升高，而在功能失调和耗竭细胞中明显下降。

为了验证ZEB2在T细胞分化中的具体作用，研究团队构建了KP.SIY肺癌小鼠模型。通过两种不同的实验方案——内源性CD8⁺T细胞分析和TCR转基因T细胞过继转移，他们发现Zeb2基因表达在肺肿瘤反应性Teff细胞中显著诱导，而在记忆性T细胞（Tems）和初始CD8⁺T细胞中表达极低。更重要的是，在Zeb2条件性敲除小鼠中，肺肿瘤反应性CD8⁺T细胞数量和Teff细胞比例均显著减少，Teff特征基因的表达也明显下调。

进一步机制研究表明，ZEB2在T-bet下游发挥作用。T-bet能够直接结合Zeb2启动子区域，调控其表达。当在Zeb2敲除的Teff细胞中过表达T-bet时，无法有效上调Teff特征基因的表达，表明ZEB2是T-bet发挥功能所必需的。

IoIL-7Ra Ih) on the indicated days post-tumor inoculation in WT mice using the a endogenous CD8+ model and the(c) TCR 2C+CD8+adoptive transfer model. b,d Correlation analysis of Tbx21 mRNA expression and Zeb2 mRNA expression in SIY-reactive Teff cells on days 7 post-tumor inoculation in WT mice using the(b) endogenous CD8+ model and the(d) TCR2c+CD8+ adoptive transfer model. e,f The percentage of SIY-reactive CD8+ cells on the indicated days post-tumor inoculation in Tbx21-floxed(Tbx21f1/f1) mice and Tbx21f1/f1; Gzmb-Cre(Tbx21-/-) mice using the(e) endogenous CD8+ model and the(f) TCR2c+CD8+ adoptive transfer model. g,h Analyses performed in the TCR2C+CD8+adoptive transfer model on day 7 post-tumor inoculation. d(left)qPCR analysis of Tbx21mRNAexpression in Sly-reactive TCR2C+CD8+Teff donor cells derived from Zeb2-floxed (Zeb2fl/fl)and Zeb2 fl/fl; Gzmb-Cre (Zeb2?/?)mice;(right) qPCR analysis of Zeb2 mRNA expression in SIY-reactive TCR2C+CD8+T effdonor cells derived from Zeb2 fl/fland Zeb2 fl/fland Tbx21 ?/?mice. h ChIP analysis performed with an anti-T-bet or IgG control antibody at the 3'UTR(-3 kB) and transcription start site(TSS) in SIY-reactive TCR2c+CD8+ Teff donor cells derived from Tbx21f fl and Tbx21-/- mice.i Tumor-reactive TCR2c+CD8+ donor cells derived from Zeb2f/fl and Zeb2-/- mice were spin-transduced with a retroviral T-bet overexpression vector(T-bet-OE) or empty control vector(Ctrl) and introduced to recipient tumor-bearing mice. qPCR analysis of Teff-signature genes in SIY-reactive TCR2c+CD8+ Teff cells on day 7 post-tumor inoculation. Data depicts means±SDs from n=12 mice/group.P<0.05;*P<0.01[a-f two-way ANOVA, g t-test, h, i one-way ANOVA].'>

在治疗应用方面，研究团队发现T-bet或Zeb2过表达能够显著抑制KP.SIY肺癌生长，延长小鼠生存期，且这种效果不依赖于ICB治疗。更重要的是，他们证明T-bet/ZEB2轴是IL-2和IL-12联合免疫疗法的关键介质。当使用小鼠血清白蛋白融合的细胞因子（IL2-MSA+IL12-MSA）进行治疗时，其抗肿瘤效果在Tbx21或Zeb2敲除小鼠中完全消失。

机制上，IL2-MSA+IL12-MSA通过平行的STAT4/FOXO1信号通路发挥作用。IL-12通过激活STAT4促进T-bet表达，而IL-2通过AKT信号通路磷酸化FOXO1，解除其对T-bet转录活性的抑制，从而协同上调T-bet/ZEB2轴的表达，促进Teff细胞分化。

本研究的关键技术方法包括：基于14例初治NSCLC患者样本的单细胞RNA测序分析、metaVIPER算法构建基因调控网络、KP.SIY肺癌小鼠模型建立、条件性基因敲除技术、流式细胞术分析T细胞亚群、染色质免疫沉淀（ChIP）验证转录因子结合、以及细胞因子融合蛋白治疗实验。

metaVIPER-based scRNA-seq分析揭示ZEB2驱动CD8⁺T细胞分化

通过对NSCLC患者CD8⁺T细胞的单细胞测序数据分析，研究人员识别出九个不同的T细胞亚群，并通过Monocle算法推断出CD8⁺T细胞的分化轨迹。分析显示，初始T细胞主要分化为细胞毒性效应分支和功能失调/耗竭分支，而ZEB2在效应分支中表现出最高的转录活性。

Zeb2促进肺肿瘤反应性Teff细胞分化

在KP.SIY肺癌模型中，Zeb2表达在Teff细胞中显著上调，而在Zeb2敲除小鼠中，Teff细胞分化和功能相关基因表达受损，证实了Zeb2在促进效应T细胞分化中的关键作用。

ZEB2在T-bet下游发挥作用促进Teff细胞分化

机制研究表明，T-bet直接调控Zeb2表达，且Zeb2是T-bet发挥功能所必需的下游因子。在Zeb2缺失的情况下，T-bet过表达无法有效促进Teff特征基因的表达。

T-bet/ZEB2轴独立于ICB发挥抗肿瘤作用

过表达T-bet或Zeb2能够显著抑制肺癌生长，提高CD8⁺T细胞的细胞因子产生能力和杀伤活性，且这种效果不依赖于免疫检查点阻断治疗。

T-bet/ZEB2轴介导IL-2+IL-12联合免疫疗法效果

IL2-MSA+IL12-MSA的治疗效果完全依赖于T-bet/ZEB2轴的存在，在Tbx21或Zeb2敲除小鼠中，细胞因子联合疗法的抗肿瘤作用完全消失。

IL2+IL12免疫疗法通过STAT4/FOXO1机制促进T-bet/ZEB2表达

IL-12通过STAT4信号通路，而IL-2通过AKT-FOXO1信号通路，协同促进T-bet和Zeb2的表达，从而驱动Teff细胞分化。

该研究首次系统地揭示了ZEB2在NSCLC肿瘤微环境中CD8⁺T细胞分化调控网络中的核心地位，不仅阐明了T-bet/ZEB2轴在抗肿瘤免疫中的关键作用，还为改善NSCLC免疫治疗提供了新的靶点。研究表明，通过调控ZEB2活性来促进效应T细胞分化，可能成为克服ICB治疗抵抗的有效策略。特别是IL-2和IL-12联合疗法通过STAT4/FOXO1信号通路上调T-bet/ZEB2轴的发现，为开发新的免疫治疗组合方案提供了重要理论依据。

这项研究的意义在于它将基础研究发现与临床治疗策略紧密结合，不仅深化了对T细胞分化机制的理解，更重要的是为改善当前肿瘤免疫治疗效果提供了切实可行的研究方向。未来针对ZEB2通路的调控可能成为提高NSCLC患者免疫治疗应答率的重要突破口。