吲唑衍生物通过构象重激活上调p53-Y220C热不稳定突变体细胞活性的研究

《Cell Death Discovery》：Cellular activity upregulation of the thermolabile p53 cancer mutant Y220C by small molecule indazole derivatives

本研究针对p53-Y220C突变导致的肿瘤抑制功能丧失问题，开发了新型(1H-吡咯-1-基)吲唑衍生物JC16/JC36。研究证实这些化合物能选择性诱导p53-Y220C突变癌细胞凋亡，通过构象重激活恢复p53转录活性，上调BBC3(PUMA)等靶基因表达，为p53突变癌症治疗提供了新策略。

　　

在人类癌症的基因图谱中，TP53基因的突变堪称"明星罪犯"——超过半数肿瘤都存在这个关键肿瘤抑制基因的异常。其中，Y220C突变因其独特的机制备受关注：这个位点的突变不仅使p53蛋白失去抑癌功能，还在蛋白表面形成一个特殊的疏水口袋，如同给这个"守护基因"装上了一把可被药物靶向的"锁"。

传统的癌症治疗手段往往对p53突变肿瘤效果有限，这使得科学家们将目光投向"突变p53重激活"这一前沿领域。尽管已有APR-246、Rezatapopt等化合物进入临床研究，但大多数小分子仍面临结合力不足、毒性较大等挑战。因此，发现能够有效重激活突变p53的新型化合物支架，成为当前癌症治疗研究的重要方向。

在这项发表于《Cell Death Discovery》的研究中，来自喀山联邦大学和南安普顿大学的联合团队报告了一系列新型(1H-吡咯-1-基)吲唑衍生物的发现。这些化合物能选择性重激活p53-Y220C突变体，恢复其转录功能，为靶向p53突变癌症提供了新的治疗策略。

研究人员主要运用了表型筛选、细胞活力检测、实时细胞分析、流式细胞术、免疫荧光染色、Western blot和定量PCR等关键技术方法。其中细胞模型包括内源性表达p53-Y220C的HUH7肝癌细胞、通过CRISPR/Cas9和慢病毒转染构建的MCF7 p53-Y220C细胞等不同p53状态的细胞系。

化合物库筛选与选择

研究团队基于已知p53-Y220C结合剂的结构特征，对内部5000多个杂环化合物库进行针对性筛选。通过相似性搜索和理化性质筛选，最终优选出JC16、JC36和JC65三个吲唑衍生物。这些化合物均具有(1H-吡咯-1-基)吲唑核心结构，在1位含有可电离的N,N-二甲基乙胺基团，3位连接吡咯环，5位分别带有硝基、溴代和甲氧基取代基。

吲唑衍生物诱导细胞p53-Y220C稳定化

通过PAb1620抗体免疫荧光分析，研究人员发现JC16和JC36能特异性识别p53蛋白的野生型构象。在HUH7 p53-Y220C细胞中，这两种化合物处理显著增加了PAb1620荧光信号，表明突变p53发生了向野生型构象的转变。然而在微分扫描荧光法(DSF)实验中，这些化合物对重组p53-Y220C DNA结合结构域(DBD)的热稳定性影响有限，提示其作用机制可能不依赖于直接结合。

化合物对不同p53状态细胞系活力的影响

MTS实验显示，JC16和JC36对p53-Y220C突变癌细胞表现出显著的选择性细胞毒性。在120μM浓度下，JC36将HUH7 p53-Y220C细胞活力降低至22%，而对非癌性HSF成纤维细胞影响轻微。实时细胞分析(xCELLigence)进一步证实了这种选择性抗增殖效果，JC36在120μM浓度下使HUH7细胞增殖减少80%。

吲唑衍生物对凋亡诱导的影响

流式细胞术分析显示，JC16和JC36能显著促进p53-Y220C突变细胞的凋亡。在HUH7细胞中，JC16和JC36分别使总凋亡细胞增加7倍和14倍。这种促凋亡效应在內源性表达突变p53的细胞中更为明显，体现了化合物对Y220C突变癌细胞的选择性杀伤作用。

突变p53转录活性的影响

定量PCR分析表明，JC36能显著上调HUH7和MCF7 p53-Y220C细胞中BBC3(PUMA)的表达，激活p53依赖性凋亡通路。同时，JC16和JC36还不同程度地调节CDKN1A(p21)和MDM2的表达，这种转录激活效应在不同细胞模型中表现出情境依赖性。

吲唑衍生物对p53蛋白表达的影响

Western blot分析揭示了一个有趣的现象：在內源性表达p53-Y220C的HUH7细胞中，JC16和JC36处理并未显著改变总p53蛋白水平，但在慢病毒重建的MCF7 p53-Y220C细胞中却观察到p53蛋白积累。这表明化合物的作用机制可能因细胞背景而异，涉及构象重激活和蛋白稳定化等多种途径。

这项研究的重要意义在于发现了一类新型(1H-吡咯-1-基)吲唑衍生物作为p53-Y220C突变的有效重激活剂。JC16和JC36能选择性诱导突变p53癌细胞的凋亡，通过构象重激活机制恢复p53的转录功能，上调BBC3(PUMA)等关键靶基因的表达。尽管这些化合物在体外实验中未表现出强烈的直接结合能力，但其细胞活性表明可能通过间接机制或细胞环境依赖性稳定化发挥作用。

研究结果强调了p53靶基因调控的情境依赖性特征，为理解小分子化合物如何在不同细胞背景下调节突变p53功能提供了新视角。这些发现不仅为开发靶向p53-Y220C突变的新型抗癌药物奠定了坚实基础，也为深入研究p53生物学及其在肿瘤抑制中的关键作用开辟了新途径。

未来研究需要通过生物物理靶点结合鉴定、转录组学分析和详细的构效关系研究，进一步阐明这些化合物的特异性作用机制。在更广泛的p53-Y220C突变模型（包括体内系统）中评估这些化合物，对于评估其治疗相关性和转化潜力至关重要。理解直接药理伴侣作用之外的稳定化机制，可能为治疗p53突变癌症提供新策略，并补充现有的重激活方法。