靶向Wnt5a-ERK通路修复Shank3缺陷所致自闭症谱系障碍的髓鞘形成障碍

《Molecular Psychiatry》：Shank3 related oligodendrocyte alterations in autism are restored by Erk pathway inhibition

本研究针对SHANK3相关自闭症谱系障碍(ASD)中持续存在的白质异常现象，深入探讨了少突胶质细胞功能障碍和髓鞘形成缺陷的机制。研究人员发现Shank3缺陷通过Wnt5a-ERK信号轴导致少突胶质细胞前体细胞(OPC)增殖异常和成熟受阻，而ERK通路抑制剂Mirdametinib能有效恢复少突胶质细胞成熟，挽救髓鞘形成缺陷，并部分改善自闭症相关行为。该研究为SHANK3相关ASD的治疗提供了新的靶点策略。

　　

在探索自闭症谱系障碍(ASD)的神经生物学基础时，科学家们注意到一个令人困惑的现象：尽管ASD通常被认为是突触连接异常导致的疾病，但脑成像研究却一致发现患者存在广泛的白质异常。特别是在SHANK3基因相关ASD中，白质缺陷尤为突出，表现为胼胝体体积减小和髓鞘形成紊乱。SHANK3基因突变是ASD中最具重现性的遗传发现之一，其编码的SHANK3蛋白作为突触后支架蛋白，在神经元通讯中起关键作用。然而，白质异常与ASD多样症状之间的具体联系机制，特别是少突胶质细胞发育障碍的分子基础，长期以来一直是个未解之谜。

少突胶质细胞是中枢神经系统的"绝缘工程师"，它们通过包裹轴突形成髓鞘，确保神经信号高效传导。从少突胶质细胞前体细胞(OPC)到成熟髓鞘形成少突胶质细胞的发育过程受到严格调控，任何环节的紊乱都可能对脑功能产生深远影响。尽管已知Erk信号通路在塑造少突胶质细胞形态和调节髓鞘合成中起关键作用，但Shank3缺陷如何干扰这一过程仍不清楚。

这项发表在《Molecular Psychiatry》的研究正是为了解开这一谜团。研究人员通过整合体内外实验模型，揭示了Shank3缺陷通过Wnt5a-ERK信号轴破坏少突胶质细胞发育的新机制，并验证了靶向干预这一通路的治疗潜力。

关键技术方法

研究团队采用Shank3△11(-/-)基因敲除(KO)小鼠模型，通过免疫组织化学、Western blot和RNAscope技术分析不同发育阶段(出生后7天、21天、140天)胼胝体中少突胶质细胞谱系动态。建立原代少突胶质细胞培养体系，利用免疫细胞化学评估细胞增殖、分化和成熟。通过转录组测序(RNA-seq)筛选差异表达基因，采用基因集富集分析(EGSEA)鉴定信号通路。使用MEK抑制剂Mirdametinib(PD0325901)进行体内外干预，通过行为学测试(大理石埋藏实验、旷场实验、物体探索实验、倒置网格测试)评估治疗效果。

年龄依赖性少突胶质细胞成熟紊乱

研究发现Shank3缺陷小鼠的少突胶质细胞发育表现出复杂的年龄依赖性模式。在出生后7天(P7)，胼胝体中MBP阳性成熟少突胶质细胞数量增加，但其中具有髓鞘形成功能的细胞比例显著降低(37.16% vs 65.53%)。发育轨迹分析显示，P7时Shank3 KO小鼠中Olig2⁺CC1⁺成熟少突胶质细胞比例异常升高(10.63% vs 3.54%)，但在P21(36.87% vs 52.75%)和P140(16.35% vs 71.66%)则显著降低。Ki67染色显示P7时增殖细胞增加，且不与星形胶质细胞(GFAP⁺)或小胶质细胞(Iba1⁺)共定位，表明少突胶质细胞谱系细胞增殖增强。

原代少突胶质细胞发育缺陷

原代细胞培养实验进一步证实了Shank3缺陷的细胞自主性效应。Shank3 KO原代少突胶质细胞表现出OPC增殖增强(Ki67⁺Olig2⁺细胞比例升高)， premature少突胶质细胞(O4⁺)形态异常，以及成熟少突胶质细胞(MBP⁺)髓鞘膜片面积减小和MBP表达强度降低。时间进程分析显示，从DIV14到DIV20，KO细胞的MBP强度 progressively降低，支持成熟受损的结论。

转录组学揭示分子机制

转录组分析发现，Shank3缺陷少突胶质细胞中髓鞘相关基因(如Gjc2、Pllp、Mal、Mobp等)下调，而Wnt信号通路基因显著上调。聚类分析将上调的生物学过程术语分为五个主要群集，其中最大的群集被鉴定为Wnt信号通路。关键调控因子包括Fzd3、Fzd6、Wnt5a、Sfrp1和Vangl2，其中Wnt5a通过Ror2受体激活ERK，是非经典Wnt信号的关键配体。

Wnt5a-ERK信号轴验证

机制研究表明，Shank3 KO少突胶质细胞中Wnt5a表达上调，β-catenin水平也显著升高。Wnt5a处理可复制Shank3缺陷表型，抑制MBP⁺细胞分化并减小膜片面积。下游信号分析显示，Wnt5a特异性激活JNK和ERK信号，而Shank3缺陷细胞中主要表现ERK和磷酸化ERK水平升高。ROR2抑制剂处理能显著降低ERK磷酸化，证实ROR2依赖的Wnt5a信号介导了ERK激活。

<0.01,n=6 independent cultures.C Primary oligodendrocytes of WT were treated with vehicle(PBS)and Wnt5a 300 ng/ml for 48 h and stained for MBP. The membrane sheet of MBP positive cells were shown after normalized to the mean value. Violin plot, Mann-Whitney test, p<0.0001, n=20 MBP+ cells from 3 independent cultures. Scale bar= 20μm. D Primary oligodendrocytes of WT were treated with vehicle(PBS) as Control(CTRL), Wnt3a and Wnt5a(100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml, 48 h),respectively. Western blots were immunolabeled for LRPG, phospho-LRP6,β-catenin, JNK, phospho-JNK, Erk and phospho-Erk and normalized to total protein(Shown in Suppl Fig. 4B). Western blot bands of control, Wnt3a(300 ng/ml), Wnt5a(300 ng/ml) were analysed. Western blot bands of phospho-JNK and phospho-Erk under all the conditions were analysed. Mean± SD, Dunnett's multiple comparison test, p<0.05,p<0.01,p<0.001,n=3 independent WT cultures.E Primary oligodendrocytes of WT and Shank3 KO were lysed and Western blots of LRP6, phospho-LRP6,β-catenin, JNK, phospho-JNK, Erk and phospho-Erk were analyzed. Mean±SD. Student's paired t test, p<0.05, n=3 independent cultures.F Primary oligodendrocytes of WT and Shank3 KO were immunostained for Erk and MBP, and Erk expression within MBP+cells was analyzed, and normalized to mean value. Mean±SD.Student's paired t test,p*<0.01,n=3 independent cultures.Scale bar=20 μm.'>

体内ERK信号时空变化

体内实验显示，Shank3缺陷小鼠胼胝体中ERK信号呈现时间特异性变化：P7时磷酸化ERK(pERK)和pERK/ERK比值有升高趋势，P21和P140则显著下调。细胞特异性分析发现，P7时总ERK免疫反应性主要在未成熟少突胶质细胞(O4⁺)和星形胶质细胞(GFAP⁺)中升高，而磷酸化ERK阳性细胞数增加主要表现为GFAP⁺星形胶质细胞中升高，O4⁺细胞中反而降低。

ERK抑制的治疗潜力

行为学实验表明，MEK抑制剂Mirdametinib治疗能部分改善Shank3缺陷小鼠的自闭症相关行为和运动功能。在旷场实验中增加总运动距离，改善探索行为；在物体探索实验中增加对新奇物体的调查时间；在倒置网格测试中从第7天起延长跌落潜伏期。分子水平上，ERK抑制显著恢复了KO小鼠胼胝体中MBP表达水平。体外实验中，PD0325901处理能挽救Shank3缺陷少突胶质细胞的MBP表达和增殖表型。转录组分析进一步证实，ERK抑制引起从OPC向更成熟少突胶质细胞状态的转变，并挽救了离子转运、钙信号和细胞外基质通路相关基因集。

研究结论与意义

本研究系统阐明了Shank3缺陷通过Wnt5a-ERK信号轴破坏少突胶质细胞发育和髓鞘形成的分子机制。研究发现早期ERK过度激活驱动OPC增殖但阻碍其分化为成熟髓鞘形成细胞，导致持久的白质完整性缺陷。重要的是，ERK通路抑制不仅能恢复少突胶质细胞成熟和髓鞘形成，还能改善自闭症相关行为，为SHANK3相关ASD的治疗提供了新的靶向策略。

该研究的创新性在于将Shank3的功能从传统的神经元突触作用扩展到胶质细胞调控，特别是少突胶质细胞发育和髓鞘形成领域。Wnt5a-ERK轴的发现为理解ASD中白质异常提供了新的分子框架，而ERK抑制的治疗效果则展示了靶向胶质细胞机制改善神经发育障碍症状的潜力。这些发现不仅深化了对ASD病理生理机制的理解，也为开发针对白质病理的疾病修饰疗法奠定了理论基础。

研究选择的P28干预时间点具有重要临床意义，表明即使在病理确立后开始治疗，仍能通过"重置"异常信号通路实现功能恢复。Mirdametinib作为血脑屏障穿透性MEK抑制剂，其临床安全性已有初步数据支持，为将其重新用于SHANK3相关ASD的治疗提供了有力依据。未来研究需要进一步验证这一策略在人类系统中的适用性，并探索其在其他ASD亚型中的潜在应用价值。