《Sleep Medicine》：Cerebellar GluN2C protects against sleep deprivation-induced cognitive impairment and motor incoordination
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睡眠剥夺导致小脑GluN2C表达下降，过表达GluN2C可改善认知和运动协调障碍，其机制涉及nNOS/NO信号通路。
周瑞英|陈新月|高瑞琪|陈子妍|娄硕|刘思宇|王洪琦|杜晓强|杜家贺|张贵涛|李辉|宋一志|常丽荣|吴艳
首都医科大学脑疾病研究所神经再生与修复重点实验室基础医学科学学院解剖学系，北京100069，中国
摘要
睡眠不足，尤其是长期睡眠不足或临床睡眠障碍，是一个全球性的健康问题，影响着数百万人，并与认知能力加速下降和痴呆风险增加有关。最近的研究表明，小脑传统上被认为是运动控制中心，但现在认为它还调节情绪、认知和睡眠。新兴证据显示，小脑表现出与睡眠阶段相关的活动，并且与学习和记忆过程密切相关。N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体亚基GluN2C在小脑颗粒细胞中高度表达，但其在睡眠不足引起的认知障碍中的作用尚不清楚。在这里，我们使用14天的睡眠剥夺（SD）小鼠模型发现，SD导致小脑GluN2C的mRNA和蛋白质水平降低。在小脑颗粒细胞中过表达Grin2c（GluN2C的编码基因）可以将GluN2C蛋白恢复到对照组水平，并缓解SD引起的认知缺陷、运动协调障碍和突触蛋白丢失。此外，Grin2c的过表达还能逆转SD引起的神经元一氧化氮合酶（nNOS）和一氧化氮（NO）的减少。在培养的小脑颗粒细胞中，GluN2C激动剂可以增加nNOS和NO，而GluN2C抑制剂则会减少这两种物质；选择性阻断nNOS可以消除GluN2C激动剂引起的NO升高。我们的发现揭示了GluN2C在小脑颗粒细胞中对抗SD引起的认知和运动功能障碍的先前未被认识的作用，这可能是通过nNOS/NO信号通路实现的。因此，针对GluN2C可能为治疗与睡眠障碍相关的认知下降和运动协调障碍提供一种策略。
引言
睡眠是一种重要的生理活动，对于维持学习和记忆至关重要。睡眠不足是一个常见的健康问题，会影响认知和情绪[1]。以往关于睡眠的研究主要集中在下丘脑、脑干、大脑皮层和海马体[2]，以及它们之间复杂的相互联系[3]。然而，作为运动控制的中枢，小脑在睡眠和睡眠障碍研究中被很大程度上忽视了。最近的证据表明，小脑参与了睡眠调节、睡眠-觉醒转换、学习和记忆巩固，以及情感和认知[4],[5],[6]。多种与睡眠-觉醒相关的基因广泛分布在小脑中，在睡眠期间这些基因的表达会增加，从而影响突触传递和突触可塑性[7]。一项针对健康参与者的EEG-fMRI研究表明，从清醒状态到深度睡眠期间小脑的连接性会发生变化[8]。另一项fMRI研究显示，小脑血氧水平依赖性（BOLD）信号的增加与睡眠纺锤波有关，这可能通过丘脑通路影响程序性记忆的巩固[9]。此外，慢性失眠患者的小脑灰质体积显著减少[5]。在致命性家族性失眠患者中，小脑还表现出中度萎缩和海绵状变化[10]。
N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDARs）是异源四聚体的谷氨酸门控离子通道，可以介导兴奋性突触传递，对学习和记忆至关重要[11],[12],[13]。中枢神经系统中的大多数NMDAR由两个必需的GluN1亚单位和两个调节性GluN2（GluN2A-2D）亚单位组成。其中，GluN2亚单位是决定NMDARs药理和功能异质性的主要因素[13]。与中枢神经系统中对GluN2A和GluN2B的广泛研究相比，对GluN2C的研究相对较少。GluN2C亚单位在成年小脑颗粒细胞中高度表达[14]。先前的研究表明，过表达GluN2C可以保护小脑颗粒细胞免受NMDA诱导的毒性[15]。Hillman等人发现，GluN2C敲除小鼠的工作记忆和恐惧学习能力受损[16]。在缺血动物模型中，GluN2C的表达增加可以促进神经元存活，而敲除GluN2C则会加重神经元死亡并加剧全脑缺血后的空间记忆障碍[17]。这些发现表明GluN2C可能与记忆和认知有关。然而，GluN2C在小脑颗粒细胞中在睡眠不足引起的认知障碍中的作用及其潜在机制仍不清楚。
在这里，我们使用14天的睡眠剥夺（SD）小鼠模型发现，SD导致小脑GluN2C的mRNA和蛋白质水平显著降低。在小脑颗粒神经元中过表达Grin2c（GluN2C的编码基因）可以缓解SD引起的认知缺陷、运动协调障碍和突触蛋白丢失。此外，Grin2c的过表达还能逆转SD引起的神经元一氧化氮合酶（nNOS）和一氧化氮（NO）的减少。进一步地，在培养的小脑颗粒细胞中，激活或抑制GluN2C可以分别显著增加或减少nNOS和NO。我们的研究揭示了小脑GluN2C在对抗SD引起的认知和运动缺陷方面的新保护作用，可能是通过调节nNOS/NO信号通路实现的。因此，针对GluN2C可能为治疗睡眠障碍相关的认知下降和运动协调障碍提供一种潜在方法。
抗体和试剂
本研究中使用的主要化学物质、试剂和抗体列于表1中。
动物
本研究中使用了8-10周大的C57BL/6雄性小鼠和出生后第7天的C57BL/6雄性小鼠（混合性别）（SPF等级，来自中国北京Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd.）。8-10周大的C57BL/6雄性小鼠在相对恒定的环境条件下饲养，湿度为55 ± 3%，饲养温度为22-23 °C，环境保持稳定
睡眠剥夺会导致认知能力下降、运动协调障碍和小脑突触蛋白丢失
首先，我们建立了一个睡眠剥夺（SD）小鼠模型。经过14天的睡眠限制后，分别使用新物体识别（NOR）、Y迷宫、恐惧情境测试（FCT）和旋转棒测试来评估小鼠的认知和运动能力（图1A）。NOR测试的结果显示，SD显著降低了辨别指数（DI）（SD：0.42 ± 0.15 vs. 对照组：0.60 ± 0.04，P < 0.01）（图1B）。Y迷宫测试显示，接受SD处理的小鼠表现出
讨论
我们的研究表明，小脑颗粒细胞中的GluN2C可以保护小脑免受SD引起的认知和运动协调障碍。GluN2C的保护作用是通过nNOS/NO信号通路实现的，该通路可以改善突触可塑性，从而缓解认知下降和运动协调障碍。这些发现揭示了小脑GluN2C在保护睡眠剥夺方面的先前未被认识的作用和潜在机制，可能为未来研究铺平了道路
作者贡献声明
吴艳：撰写 – 审稿与编辑，资源准备，概念构思。陈子妍：方法学，实验设计。娄硕：方法学，实验设计。刘思宇：方法学。王洪琦：方法学。杜晓强：方法学。杜家贺：方法学。张贵涛：方法学。李辉：资源准备。宋一志：数据可视化，形式分析。周瑞英：撰写 – 初稿撰写，数据可视化，方法学，实验设计，数据管理。常丽荣：撰写 – 审稿与编辑，资源准备，
利益冲突声明
? 作者声明他们没有可能影响本文所述工作的已知财务利益或个人关系。
致谢
本项工作得到了北京市自然科学基金（7252002）、北京市教委研发计划（KZ202110025032）、国家自然科学基金（81771370, 82071514）以及北京农业大学内部科研专项项目（KYZX-2024001）的支持。
