针对肽-MHC（Peptide-MHC）的逆转录病毒能够使肿瘤特异性T细胞在体内扩增，并实现基因向这些T细胞的递送

《SCIENCE ADVANCES》：Peptide-MHC–targeted retroviruses enable in vivo expansion and gene delivery to tumor-specific T cells

肿瘤浸润淋巴细胞疗法通过利用内源性T细胞启动有效的抗肿瘤反应，但其体外扩增周期长影响疗效。本研究提出一种pMHC靶向逆转录病毒策略，在体内直接递送连接性IL-12至抗原特异性CD8 T细胞，增强其激活和扩增能力，同时减少体外扩增时间。实验显示，该策略能有效控制B16F10黑色素瘤小鼠的肿瘤生长，延长生存期，并诱导长期记忆性T细胞。该技术为TIL疗法提供了更高效的体内工程化方案。

　　肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）疗法已显示出利用内源性T细胞启动有效抗肿瘤反应的潜力。尽管在临床试验中表现出前景，但目前的TIL生产流程需要数周的体外扩增，这可能影响治疗效果。因此，需要更多工具来对TIL进行工程化改造，以提高其效力并解决制造过程中的挑战。本文提出了一种利用肽-主要组织相容性复合物（pMHC）伪型化逆转录病毒的方法，用于抗原特异性基因递送至CD8 T细胞，并在免疫功能完整的鼠模型中验证了其治疗效果。研究显示，这种pMHC靶向的病毒能够特异性地将功能增强的载荷递送至T细胞，同时激活和扩增抗肿瘤T细胞。这种靶向精度使得可以在体内对肿瘤特异性T细胞进行工程化改造，从而在携带B16F10肿瘤的鼠中显著提高总体生存率。通过这些方法，我们确立了pMHC靶向病毒作为直接在体内重编程和扩增肿瘤特异性T细胞的有效载体，有望大幅简化工程细胞疗法的生产流程。

研究背景表明，采用性细胞疗法是一种有前途的癌症治疗方法，通过扩增或基因改造的T细胞来识别并强力杀伤肿瘤细胞。TIL疗法已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗晚期黑色素瘤，成为首个获批用于实体瘤的细胞疗法。TIL疗法的生产通常涉及从肿瘤切除物中分离自体T细胞，并在体外进行大量扩增后再回输到患者体内。早期的探索表明，TIL疗法在转移性黑色素瘤患者中能够诱导长期缓解，随后在多种癌症中检测到不同频率的TIL，强调了这些细胞作为治疗手段的潜在价值。

然而，TIL产品的表型和质量已被证明对临床结果有显著影响。在回输前，TIL常表现出耗竭表型，这是由于其先前在肿瘤内的抗原暴露和体外扩增过程的延长，这会阻碍它们发起积极且持久的抗肿瘤反应。为了缓解这一问题，可以考虑在生产协议中加入额外的工程策略，以改善细胞的效力，如递送免疫刺激性载荷和减少免疫抑制信号。然而，当前的方法会将这些修改施加到TIL扩增过程中所有的T细胞，增加了潜在的毒副作用，并进一步增加了制造的复杂性。其他工程细胞疗法的研究表明，从T细胞分离到回输的时间间隔越长，移植细胞的持续时间和效力就越低，这再次强调了减少生产时间以提高治疗成功率的重要性。因此，开发新的策略来激活和增强抗肿瘤反应对于TIL疗法的临床转化至关重要。

为了克服这些挑战，研究团队致力于开发能够直接在体内修改肿瘤特异性T细胞的基因递送载体。当前的努力集中在生成具有特定T细胞系标志物（如CD3、CD8、CD4、CD62L和CD5）有限病毒亲和力的病毒载体。虽然这些策略适用于生成CAR-T细胞，但它们并不适合抗原特异性转导，这可能有助于提高TIL疗法的效果。最近，有研究展示了针对抗原特异性T细胞的靶向基因递送，依靠显示pMHC被T细胞克隆的T细胞受体（TCR）识别。脂质纳米颗粒通过pMHC靶向已被证明可以实现体内抗原特异性递送mRNA编码的载荷，但长期的转基因表达可能需要更进一步的优化。虽然有证据表明，使用TCR-pMHC相互作用在体外通过慢病毒载体递送功能性载荷是可行的，但尚未有研究评估显示pMHC的病毒作为抗肿瘤免疫治疗剂的有效性。

研究团队展示了pMHC靶向病毒可以有效地重新编程抗肿瘤T细胞群体，递送产生有效抗肿瘤反应的治疗载荷。首先，他们建立了一个小鼠模型来研究病毒工程化抗原特异性T细胞的全面功能。与使用异种移植模型不同，他们选择将pMHC靶向病毒适应于同源模型，以更准确地评估这些载荷的功能。为了验证这一方法，他们使用了TRP1^high TCR转基因小鼠作为CD8 T细胞的来源，这些T细胞能够识别描述良好的黑色素瘤抗原TRP1，并具有生理pMHC：TCR亲和力。基于之前在TRP1^high系统中的研究，他们选择了TRP1表位的强激动剂肽模拟物AAPDLGYM，以H2-D^b为载体，作为初始靶向分子进行概念验证。考虑到之前报道的慢病毒在小鼠T细胞中的感染效率有限，他们将这一靶向策略调整为使用小鼠白血病γ逆转录病毒（MuLV）作为病毒载体，用于pMHC和融合蛋白的共显示。

研究假设pMHC显示的病毒颗粒能够选择性地激活抗原特异性目标细胞，在一群初始T细胞中。因此，他们评估了A1靶向病毒在显示未突变VSVG、VSVGmut或来自Moloney小鼠白血病病毒的嗜同源包膜蛋白（Eco）时的效率。他们使用携带荧光载荷（ZsGreen）的靶向慢病毒，将TRP1^high和非靶向的B6小鼠CD8 T细胞混合后进行转导。结果显示，在所有病毒中，A1与Eco融合的病毒（A1-ZsG）在TRP1^high细胞中实现了最高的转导效率。非同源pMHC（显示卵白蛋白衍生肽）或仅显示Eco的病毒未能在未激活细胞中实现转导，但在预激活细胞中，仅显示Eco的非靶向病毒能够有效转导TRP1^high和B6 CD8 T细胞，验证了该病毒的非抗原特异性（图S1）。H2-D^b靶向的病毒，显示非激动剂TRP1肽TAPDNLGSM（S8-ZsG）或非靶向流感抗原ASNENMETM（NP-ZsG）时，均未能转导或激活TRP1^high T细胞，进一步表明pMHC靶向病毒的特异性由TCR对同源肽的识别驱动。

研究观察到，当A1靶向病毒添加到CD8 T细胞混合物中时，TRP1^high T细胞表现出特异性激活，而非靶向细胞未被激活。与未靶向Eco-ZsG或非靶向pMHC-ZsG病毒相比，A1-ZsG病毒在TRP1^high CD8 T细胞中诱导了相似水平的CD69和CD25表达，即使这些TRP1^high T细胞未被转导以表达ZsGreen，也观察到类似的CD25⁺CD69⁺ CD8 T细胞比例，这表明pMHC显示的病毒是抗肿瘤T细胞的强大激活剂。

接下来，研究团队评估了A1-ZsG病毒在较低初始频率下选择性转导靶向细胞的效率。在患者样本中，抗肿瘤、细胞毒性T淋巴细胞的内源频率范围从MART-1特异性T细胞的约1%到WT-1、MAGE家族和NYESO-1特异性T细胞的不到0.01%。为了模拟这种情况，他们将TRP1^high CD8 T细胞稀释到B6 CD8 T细胞中，发现A1-ZsG病毒能够在所有测试的初始频率下转导靶向细胞。此外，这些pMHC靶向病毒能够扩增稀有、同源T细胞，这表明它们可以用于递送治疗载荷以增强抗肿瘤T细胞的功能，并同时增加抗肿瘤效应T细胞的总数。

为了验证pMHC靶向策略的普遍性，研究团队展示了pMHC靶向病毒可以适应其他抗原靶点。他们生成了单链三聚体版本的H2-K^b，用于展示卵白蛋白衍生的模型抗原SIINFEKL（OVA），以及H2-L^d展示的QLSPFPFDL（QL9），这是一个2C TCR模型系统的激动剂。分别用这些pMHC和Eco进行病毒伪型化，结果显示这些载体在与非靶向B6 CD8 T细胞相比时，对同源TCR保持了高度的特异性（图2，A和B）。此外，在这些额外的系统中，pMHC靶向病毒既能够扩增又能够转导靶向T细胞（图2，C和D）。这些结果表明，他们开发了一种模块化的pMHC基于伪型化策略，可以在体外有效激活、扩增和转导稀有、多克隆的抗原特异性小鼠CD8 T细胞。

为了进一步验证这一策略的潜力，研究团队选择了一种功能性、连接的mIL-12作为治疗载荷。许多已知的遗传载荷能够增强工程化T细胞疗法的效力、迁移或安全性。他们假设pMHC靶向病毒特别适合于递送受限于全身毒性但能有效激活多种免疫细胞亚群的治疗载荷。IL-12被广泛认为可以增强抗肿瘤免疫，但由于其强烈的剂量限制性副作用而面临临床实施的挑战。他们选择了连接的mIL-12结构作为概念验证载荷，基于其在与CAR-T细胞疗法结合时已被验证的有效性。他们确认了mIL-12在使用A1-ZsG或A1–mIL-12病毒转导的TRP1^high T细胞表面的表达，使用抗mIL-12抗体进行检测。当A1病毒编码mIL-12被添加到TRP1^high和非靶向CD8 T细胞的混合物中时，A1靶向的病毒保持了对TRP1^high T细胞的特异性，如图S3所示。IL-12信号驱动IFN-γ分泌，这在所有使用mIL-12病毒转导的条件中均可检测到（图3，C和D）。这些结果进一步强调了A1靶向病毒的特异性，因为IFN-γ分泌在添加A1–mIL-12病毒的TRP1^high T细胞中显著升高，而在B6 T细胞中未观察到类似的效应。相比之下，未靶向的Eco–mIL-12病毒在TRP1^high和B6 T细胞中均引发了IFN-γ分泌。此外，使用A1–mIL-12病毒转导的TRP1^high细胞中pSTAT4信号也显著增强，这表明mIL-12结构在转导的T细胞中启动了预期的下游信号通路（图3E）。同时，在未转导的TRP1^high T细胞中也检测到升高的pSTAT4水平，表明连接的细胞因子能够通过转导的T细胞间接介导效应。这些数据表明，pMHC靶向病毒能够在体外特异性地递送功能性载荷。

在体外转导后，研究团队进一步评估了这些转导细胞在治疗背景下的功能。他们选择了B16F10黑色素瘤作为具有强烈抗原表达的肿瘤模型系统。在将B16F10肿瘤细胞皮下接种到B6小鼠后，他们从TRP1^high转基因小鼠中分离供体CD8 T细胞，并在体外用A1-ZsG、A1–mIL-12或未靶向的Eco-ZsG病毒进行转导（图4A）。作为额外对照，他们用Eco–mIL-12病毒转导激活的B6 CD8 T细胞，以确定将IL-12递送至多克隆T细胞是否足以实现治疗效果。在体外培养两天后，各组的细胞产品被评估其基础转导率和激活状态，随后进行细胞转移（图S5）。

与之前的研究一致，单独的TRP1^high T细胞不足以控制B16F10肿瘤。然而，接受A1–mIL-12转导T细胞的小鼠能够维持较小的肿瘤，在早期时间点最终获得显著的生存优势（图4，B和C）。相比之下，将连接的IL-12递送至多克隆CD8 T细胞的Eco–mIL-12组并未导致同样的长期生存，这表明连接的IL-12必须被特异性递送至抗肿瘤T细胞才能达到最大的治疗效果。尽管先前研究表明，即使通过瘤内注射，可溶性IL-12也会导致小鼠显著的体重减轻，但在接受A1–mIL-12转导T细胞治疗的小鼠中并未观察到体重减轻或其他毒性迹象（图4D）。

考虑到A1–mIL-12转导细胞对整体生存的改善，研究团队进一步验证了这些转导细胞能否在体内迁移并持续存在。按照相同的细胞转移协议，TRP1^high T细胞被体外转导并转移至B16F10肿瘤携带的小鼠体内。在转移后五天，从肿瘤、脾脏和引流淋巴结中采集样本进行分析，以确定迁移和持续的转导细胞。在所有采集的组织中，A1–mIL-12转导组的肿瘤中检测到更高比例的细胞转移CD8 T细胞，与其它实验组和其他组织中的A1–mIL-12治疗组相比（图4E）。这些结果表明，TRP1^high T细胞能够优先且高效地迁移至肿瘤。在所有病毒转导组中，转导的细胞比例（ZsGreen⁺）与转导前样本中的ZsGreen基础频率相似，这表明通过pMHC靶向病毒进行基因递送不会限制转导细胞在体内的持续性。此外，通过流式细胞术确认了肿瘤浸润、转导的CD8 T细胞表面的连接mIL-12表达（图4G），并且在这些小鼠中检测到显著增加的肿瘤浸润CD8 T细胞频率（图S6A）。在肿瘤被采集时，所有组的肿瘤大小均无显著差异（图S6B）。这些结果表明，A1–mIL-12转导的细胞能够在体内存活并迁移至肿瘤，从而在一种侵袭性、同源的肿瘤模型中实现延长生存。

考虑到A1靶向病毒在体外对多克隆群体的特异性，研究团队进一步调查了这些病毒是否能在体内直接靶向抗肿瘤T细胞。部分重建的B6小鼠接受了A1或Eco靶向病毒的静脉注射（图5A）。接受A1–mIL-12单药治疗或与抗PD1抗体（aPD1）联合治疗的小鼠相比，接受A1-ZsGreen或Eco–mIL-12病毒治疗的小鼠，其整体生存时间显著延长，这表明将治疗载荷特异性递送至肿瘤特异性T细胞对于治疗效果至关重要（图5，B和C）。尽管A1–mIL-12 + aPD1组的生存率相比A1–mIL-12组有所提高，但两者之间没有显著差异，这表明PD1并非免疫介导控制的主要因素。

通过比较转移前和转移后的TRP1^high T细胞频率，研究团队观察到注射A1–mIL-12病毒后，TRP1^high T细胞的扩增倍数显著高于A1-ZsG、Eco–mIL-12和其他对照组（图5D）。TRP1^high CD8 T细胞在病毒注射后表现出特异性激活，这通过CD25表达的增加得到证实（图5E）。虽然所有组的转导率都低于检测限，但这些结果表明，pMHC显示在病毒表面的抗原特异性细胞扩增增强了少数载荷表达T细胞的效果。与PBS对照相比，接受A1-ZsG病毒的TRP1^high T细胞没有显著增加CD25表达，这表明pMHC靶向病毒可以通过递送治疗载荷进一步微调细胞表型，如本研究中所展示的连接IL-12。

为了探索肿瘤微环境的变化，研究团队分析了第二组小鼠的组织样本，这些小鼠在病毒治疗后肿瘤大小开始分化（图6，A和B）。在A1–IL-12 + aPD1注射后，肿瘤浸润的TRP1^high T细胞数量显著增加，与PBS + aPD1和Eco–mIL-12注射的小鼠相比（图6C）。此外，在A1–IL-12 + aPD1组的肿瘤裂解物中检测到显著更多的IFN-γ，这表明连接的IL-12在体内启动了预期的下游信号，尤其是在与aPD1联合使用时（图6D）。已知IFN-γ在先天免疫细胞中的反应会导致巨噬细胞上调MHC II（图6E）。研究发现，接受A1–mIL-12 + aPD1注射的小鼠中，肿瘤浸润的MHC II高表达巨噬细胞比例显著增加，与PBS + aPD1或A1-ZsG组相比。这些结果表明，通过pMHC靶向病毒递送的连接mIL-12影响了适应性和先天性肿瘤浸润免疫细胞，驱动了靶向细胞的扩增并启动了基于IFN-γ的更广泛的免疫反应。

在体外转导后，研究团队进一步评估了这些转导细胞在体内能否形成长期记忆。他们将T细胞分为初始或近期激活的两种情况，并将它们转移到携带B16F10肿瘤的小鼠体内。所有组的小鼠在接受病毒注射后，TRP1反应性CD8 T细胞均显著扩增，表明无论是否经过体外激活，pMHC靶向病毒均能有效激活这些细胞。这些结果强调了pMHC靶向病毒在体内递送治疗载荷的能力，能够生成持久的抗肿瘤T细胞并诱导显著的生存延长。此外，接受A1–mIL-12病毒的小鼠中，有40%在40天后仍存活，这表明即使在高剂量下，pMHC靶向病毒仍能保持其对抗原特异性T细胞的靶向性。在后续的实验中，他们评估了转导后的TRP1^high T细胞在血液和肿瘤中的持久性，并观察到这些细胞表现出中央记忆（CD44⁺CD62L⁺）或效应记忆（CD44⁺CD62L^?）表型，这与未转导但仍然抗原经验丰富的tetramer⁺细胞相似。这些结果表明，通过pMHC靶向病毒进行的体内工程化能够使抗原特异性T细胞持久存在并形成长期记忆。

研究还发现，无论是否经过体外激活，接受A1–mIL-12病毒的小鼠均能显著控制B16肿瘤的生长。所有接受A1–mIL-12病毒的小鼠在40天后仍存活，而接受A1-ZsG病毒的小鼠中只有50%能够保持肿瘤清除状态。这些结果强调了pMHC靶向病毒在体内递送治疗载荷的能力，能够生成持久的抗肿瘤T细胞并诱导显著的生存延长。此外，研究团队还评估了接受病毒治疗的小鼠在肿瘤复发后的反应，发现所有小鼠的生存时间均显著延长，超过了未接受治疗的对照组。这表明，抗原特异性T细胞在体内经过工程化后，能够形成免疫记忆，对再次肿瘤挑战具有保护作用。

总体而言，研究团队通过一系列实验验证了pMHC靶向病毒在体内递送治疗载荷的有效性。他们发现，通过这种策略，可以特异性地激活和扩增抗肿瘤T细胞，同时避免对非靶向细胞的干扰。此外，pMHC靶向病毒能够诱导更广泛的免疫反应，包括适应性和先天性免疫细胞的激活，这可能进一步增强抗肿瘤效果。这些发现不仅为TIL疗法的优化提供了新思路，还展示了pMHC靶向病毒在多种疾病治疗中的潜在应用价值。通过将这些病毒用于不同的抗原特异性T细胞，可以实现更精准的治疗，提高治疗效果并减少副作用。研究还指出，这些病毒可以作为通用工具，用于多种疾病的基因治疗，特别是在需要精准靶向和高效递送治疗载荷的情况下。未来的研究可以进一步探索不同载荷与pMHC病毒伪型化策略的协同效应，以优化治疗效果并扩大其应用范围。