Oligo-CALL：一种用于研究靶向治疗耐药性的新一代条形码平台

《SCIENCE ADVANCES》：Oligo-CALL: A next-generation barcoding platform for studying resistance to targeted therapy

CRISPR技术驱动的Oligo-CALL系统通过可诱导的gRNA实现单细胞克隆追踪与药物耐药机制解析，在KRAS抑制剂耐药模型中发现DNA修复通路下调是共性耐药特征，并证实PARP抑制剂与KRAS抑制剂的协同增效作用。

　　在癌症研究中，理解治疗抵抗性是至关重要的课题，因为这种现象直接影响了靶向治疗的效果和患者的预后。传统上，科学家们依赖于细胞条形码技术来解析肿瘤细胞的异质性并追踪其克隆演变过程。然而，现有的条形码系统在效率和与单细胞转录组测序（scRNA-seq）的兼容性方面存在一定的局限性。为了解决这些问题，研究团队开发了一种名为Oligo-CALL的新型条形码系统，该系统结合了寡核苷酸诱导的gRNA（引导RNA）设计与CRISPRa（CRISPR转录激活）技术，从而实现了更精准的克隆追踪、活细胞克隆分离以及与scRNA-seq的无缝整合。

Oligo-CALL的核心设计在于将条形码序列嵌入到一个由反义寡核苷酸（ASO）控制的gRNA发夹结构中。这种设计使得条形码的活性可以被外部ASO触发，从而避免了对细胞基因组的额外修饰。在gRNA的3′端，研究人员还添加了8A8G的聚腺苷酸（poly(A)）尾部，这不仅有助于条形码的检测，还确保了其与标准scRNA-seq工作流程的兼容性。这种设计的优化使得Oligo-CALL能够实现高分辨率的细胞谱系追踪，同时保留细胞的原始基因状态，为后续的分子机制研究提供了坚实的基础。

在验证Oligo-CALL系统的有效性时，研究团队使用了H358细胞系，这是一种携带KRAS突变的非小细胞肺癌细胞。通过将Oligo-CALL条形码整合到这些细胞中，研究人员能够使用ASO诱导gRNA活性，并通过荧光信号对活细胞克隆进行分选。实验结果表明，Oligo-CALL能够实现高达95%的条形码与转录组的匹配效率，这使得研究人员能够从复杂的细胞群体中准确地识别出特定的克隆，并进一步分析其在药物压力下的行为。此外，Oligo-CALL的高特异性使得其能够有效区分匹配和不匹配的ASO，从而避免了非特异性激活的问题。

为了更深入地探讨KRAS G12C抑制剂（G12Ci）导致的治疗抵抗性机制，研究团队进行了一系列的克隆命运分析。通过将Oligo-CALL条形码引入H358细胞，并在不同时间点对这些细胞进行处理，研究人员能够观察到在药物作用下哪些克隆得以存活并扩增。结果表明，在G12Ci治疗后，某些克隆表现出高度的一致性，这些克隆在多个独立的实验重复中均被选择出来，说明治疗抵抗性可能是由这些克隆的内在特性所决定的，而非随机事件。这种确定性的抵抗模式为理解药物抵抗的分子基础提供了新的视角。

在单细胞转录组分析方面，Oligo-CALL的优势得到了充分的体现。通过在gRNA上添加8A8G尾部，研究人员能够利用标准的scRNA-seq平台同时捕获转录组信息和条形码序列。这一方法使得每个细胞的谱系信息与其基因表达谱之间建立了直接联系，从而揭示了克隆特异性基因表达模式。例如，研究人员发现，在G12Ci治疗后，某些克隆表现出DNA修复通路的显著下调，而另一些克隆则在细胞周期调控、代谢途径和氧化磷酸化方面发生了变化。这些变化可能与细胞在药物压力下的适应性反应有关，并且为开发新的联合治疗策略提供了潜在的靶点。

值得注意的是，DNA修复通路的改变在多个克隆中反复出现，这提示了该通路可能在治疗抵抗性中扮演关键角色。研究团队进一步验证了这一点，通过使用PARP抑制剂（如talazoparib）对G12Ci耐药细胞进行处理，发现这种联合治疗能够显著增强药物的抗癌效果。这一发现不仅支持了DNA修复通路作为治疗抵抗性的潜在靶点，还为临床应用提供了新的思路。PARP抑制剂在乳腺和卵巢癌治疗中已被证明具有显著的疗效，而这一研究则扩展了其在KRAS G12C突变相关肿瘤中的应用前景。

Oligo-CALL系统的另一个重要特点是其能够对活细胞克隆进行分离和扩增。通过将治疗后的克隆与原始的、未经治疗的克隆进行配对分析，研究人员能够确定哪些抵抗性特征是预先存在的，哪些是在药物作用下新获得的。例如，研究发现，一些耐药克隆在去除药物压力后恢复了对G12Ci的敏感性，而另一些则保持了稳定的耐药性。这种动态的抵抗模式表明，肿瘤细胞的抵抗性可能是多种机制共同作用的结果，包括暂时性的耐药状态和固有的基因改变。

此外，Oligo-CALL还支持对单细胞转录组数据与克隆信息的整合分析。通过将克隆的基因表达数据与条形码信息相结合，研究人员能够揭示不同克隆在药物作用下的分子响应特征。例如，某些克隆在G12Ci治疗后表现出显著的上皮-间质转化（EMT）活性，这可能与它们在药物压力下的存活能力有关。而另一些克隆则显示出对细胞周期相关通路的抑制，这可能是一种适应性策略，以减少药物对细胞分裂的影响。

Oligo-CALL的这些功能使其成为研究肿瘤异质性和治疗抵抗性的强大工具。它不仅能够提供高分辨率的谱系信息，还能够通过活细胞克隆分离和扩增，支持对克隆特异性分子机制的深入分析。这一系统为科学家们提供了一个全新的平台，能够更全面地解析靶向治疗的抵抗机制，并为开发个体化的治疗方案提供了理论依据。在未来的临床研究中，Oligo-CALL有望被用于患者的肿瘤活检分析，通过在体外扩增和标记肿瘤细胞，识别出可能对特定治疗产生抵抗性的克隆，并据此设计更有效的联合治疗策略。

总的来说，Oligo-CALL的开发为癌症研究提供了一个更加精确和高效的方法。它克服了传统条形码系统在效率和兼容性方面的不足，使得科学家能够更深入地理解治疗抵抗性的分子基础。通过将克隆追踪与单细胞转录组分析相结合，Oligo-CALL不仅揭示了治疗过程中克隆的动态变化，还为探索新的治疗靶点和优化治疗方案提供了重要的数据支持。这一技术的广泛应用将有助于推动精准医学的发展，提高癌症治疗的效果，并减少耐药性带来的挑战。