普利特利维尔（pritelivir）和阿梅内米维尔（amenamevir）抑制疱疹病毒解旋酶-引物酶作用的结构基础

《SCIENCE ADVANCES》：Structural basis of herpesvirus helicase-primase inhibition by pritelivir and amenamevir

DNA复制中的HP复合体结构解析及抑制剂作用机制研究。通过冷冻电镜技术揭示HSV-1 HP复合体（UL5-UL52-UL8）与双链DNA模板结合的3.1?结构，阐明其双叶状架构及催化协同作用。发现pritelivir和amenamevir分别占据UL5与UL52界面及UL5-α13螺旋的抑制位点，通过阻碍DNA解旋与引物合成关键域的运动，抑制复合体功能。研究为新型抗疱疹病毒药物设计提供结构基础。

　　HSV-1是一种广泛存在的疱疹病毒，能够感染多种宿主，包括人类。它通过在宿主细胞中建立生命周期内的感染模式，包括裂解和潜伏两种阶段。HSV-1感染与多种疾病有关，如角膜炎和脑炎。其基因组是一个线性、双链的DNA分子，长度约为152 kb。在HSV-1感染过程中，病毒利用其复制机制来启动DNA复制，该机制包括七个关键蛋白，其中最关键的是一类被称为“螺旋酶-引物酶（HP）复合体”的蛋白。HP复合体由三种核心蛋白组成：UL5、UL52和UL8。UL5属于螺旋酶超家族1（SF1），负责DNA的解旋，而UL52则负责引物合成，其功能类似于原核和真核引物酶（AEP）。UL8作为辅助蛋白，其结构类似于B型DNA聚合酶，可能在HP复合体的组装和功能调节中起关键作用。

尽管UL5和UL52分别被认为是HP复合体中的螺旋酶和引物酶亚基，但单独存在时它们均无法表现出相应的活性。这表明，UL5和UL52必须形成异二聚体才能激活其各自的活性。此外，UL8的结构虽然类似B型DNA聚合酶，但其没有已知的催化活性，这提示UL8可能通过其结构特性来辅助HP复合体的功能。UL8在HSV-1的DNA复制中具有重要作用，包括促进互补ssDNA的退火，形成X型和Y型的双链DNA结构，以及调节HP复合体在细胞内的定位。

HP复合体是开发抗病毒药物的一个理想靶点，因为它在DNA解旋和引物合成等过程中的功能是启动DNA复制的关键步骤。目前已有两种HP抑制剂（HPIs）——pritelivir和amenamevir，它们是通过大规模化合物筛选发现的。这些HPIs相较于传统疗法具有显著优势，包括对耐药性的抵抗力较低（大约是传统药物的1000倍）、更高的效率和更长的作用时间，因此所需的剂量和频率也更低。此外，第二代HPIs，如Innovative Molecules开发的IM-250，能够更好地抑制HSV从潜伏状态的再激活。IM-250能够穿透中枢神经系统，对动物模型中的HSV潜伏状态产生持续的抑制效果超过6个月。然而，尽管这些药物在临床应用中表现出良好的效果，其作用机制仍不明确，这主要是由于缺乏对其结合方式和如何干扰螺旋酶活性的结构信息。此外，结构数据的缺失也限制了计算机模拟在设计针对β-和γ-疱疹病毒的HPIs方面的应用。

为了深入理解HPIs的作用机制，研究人员利用冷冻电镜（cryo-EM）技术解析了HSV-1 HP复合体在与叉状DNA模板结合时的结构，以及在结合pritelivir和amenamevir时的构象变化。这些结构揭示了HP复合体在DNA复制叉处的协同作用，为HPIs如何通过结构改变来抑制螺旋酶活性提供了分子层面的解释。研究结果不仅有助于理解HSV-1的复制机制，还为开发更有效的抗病毒药物奠定了基础。

从结构上看，HP复合体呈现出一种双叶状的构型，其中UL52的N端结构域（NTD）和C端结构域（CTD）分别与UL5和UL8形成紧密的相互作用。NTD部分围绕UL5，形成一个紧凑的叶状结构（叶A），而MD则与UL8结合，形成一个延展且扁平的结构（叶B）。这些相互作用与之前的共免疫沉淀实验结果一致，表明UL5、UL52和UL8之间的结构关系对于HP复合体的功能至关重要。UL52的MD是催化域，与AEPs的催化域相似，包含三个保守的结构域（motif I至III），这些结构域在与人类Pri1亚基和古细菌pRN1的晶体结构进行比对后显示出高度的保守性。此外，UL52的CTD也包含一个锌结合位点，并且其结构类似于人类Pri2亚基和Pri1的CTD，这可能与DNA模板的结合和引物合成的启动有关。

UL5作为螺旋酶亚基，其结构包括多个保守的结构域和多个非保守的结构域。其主要功能是利用ATP或GTP的水解来驱动DNA模板的单链向双链方向的移动，从而实现DNA的解旋。通过冷冻电镜分析，研究人员发现UL5的结构由四个结构域组成（1A、1B、2A和2B），其中2A结构域的移动是螺旋酶活性的关键。然而，在当前的结构分析中，HP复合体并未结合ATP，因此研究人员利用AlphaFold3服务器构建了一个ATP结合状态下的UL5模型。模型显示，ATP的结合可能引发结构域2A的移动，从而影响DNA解旋的效率。然而，当HP复合体结合了HPIs后，这种结构域的移动被抑制，从而阻止了DNA的解旋过程。

HPIs pritelivir和amenamevir在HP复合体中的结合位置不同，但它们的结合都影响了HP复合体的结构，进而抑制了其活性。Pritelivir主要结合在UL5和UL52的接口处，形成一个部分可及的沟槽。它通过与UL5和UL52的多个侧链形成疏水相互作用和氢键，从而阻止了结构域1A和2A之间的相对移动，这可能是其抑制螺旋酶活性的关键机制。相比之下，amenamevir的结合位点更为复杂，其结构类似于pritelivir，但其分子更为庞大，具有三个头部结构。它通过占据UL5结构域1A和2A之间的空间，阻止了结构域的移动，从而干扰了DNA解旋的过程。此外，amenamevir还通过其与UL52的相互作用影响了引物酶的活性，这可能与锌离子的结合有关。

在结构分析中，研究人员还发现了一些与HPIs耐药性相关的突变。例如，与pritelivir耐药相关的突变位点（如N342K、G352R、M355T等）均位于UL5的结构域中，这些突变可能通过改变结合位点的构型来减少药物的结合效率。而与amenamevir耐药相关的突变位点（如S364G和R367H）则位于UL52的结构域中，这些突变可能通过改变UL52的结合位点，从而影响amenamevir的结合。这些突变的发现为理解HPIs的耐药机制提供了重要的线索。

研究还指出，HP复合体在DNA复制叉中的作用机制可能与人类CMG螺旋酶-引物酶复合体类似。在人类复制叉中，引物酶在没有DNA模板时处于自抑制状态，当DNA模板长度达到一定阈值时才会被激活。而在HSV-1中，HP复合体的结构和功能可能受到类似机制的调控。此外，HP复合体与宿主蛋白（如ICP8和UL30-UL42）的相互作用可能进一步影响其在细胞内的功能和稳定性。

总的来说，这些结构数据不仅揭示了HSV-1 HP复合体在DNA复制过程中的具体作用方式，还为HPIs的开发提供了重要的结构基础。通过了解HPIs如何与HP复合体相互作用，研究人员可以进一步优化药物设计，提高其对病毒的抑制效果，同时减少耐药性的发生。此外，这些结构也为其他疱疹病毒（如β-和γ-疱疹病毒）的抗病毒药物开发提供了参考，因为它们的复制机制可能具有一定的相似性。未来的研究可以进一步探索这些结构如何影响HP复合体与其他复制因子的相互作用，以及这些相互作用如何被HPIs所干扰。此外，对宿主蛋白与HP复合体的相互作用机制的研究也将有助于理解HSV-1如何在宿主细胞中建立和维持其感染状态。