DUF4352结构域通过调控分枝杆菌抗病毒免疫与生理功能的新机制

《Nucleic Acids Research》：Structural and functional relevance of the DUF4352 domain in antiviral immunity and physiology of mycobacteria

本研究揭示了分枝杆菌多拷贝噬菌体抗性蛋白Mpr中DUF4352结构域在抗病毒免疫中的关键作用。研究人员发现DUF4352具有病毒起源，能够介导Mpr寡聚化并发挥核酸外切酶活性，通过降解D29分枝杆菌噬菌体基因组实现非流产性防御。该研究首次报道了ppGp合成酶活性及其作为"警报素"的生理功能，为理解细菌-噬菌体共进化提供了新视角。

　　

在微生物世界的永恒军备竞赛中，细菌与噬菌体之间的攻防战推动着双方不断进化出精妙的防御与反防御策略。从传统的限制性内切酶系统到CRISPR/Cas适应性免疫机制，细菌已经发展出多样化的防御武器库来应对噬菌体的侵袭。然而，大多数已知的防御系统会通过流产性感染（abortive infection）牺牲被感染的细胞来保护群体，而能够同时保证个体细胞和群体存活的非流产性防御机制却鲜有报道。

在这项发表于《Nucleic Acids Research》的研究中，Sandhya Sharma和Vikas Jain团队深入探究了分枝杆菌中多拷贝噬菌体抗性蛋白Mpr的工作机制。特别聚焦于其C端DUF4352结构域在抗病毒免疫中的神秘功能。此前的研究已知Mpr能够提供对D29和L5分枝杆菌噬菌体的抗性，但其具体分子机制和DUF4352结构域的功能一直是个谜。

为了解析这一科学问题，研究人员综合运用了结构生物学、生物化学和微生物学等多学科方法。关键技术包括：蛋白质纯化与体外活性分析、圆二色谱分析蛋白质二级结构、尺寸排阻色谱研究寡聚化状态、化学交联实验、荧光显微镜观察蛋白定位、噬菌斑形成效率测定、细胞活力检测、分子动力学模拟以及下一代测序分析噬菌体逃逸突变体。

DUF4352结构域的病毒起源与功能保守性

研究发现，Mpr中的DUF4352结构域具有病毒起源，来源于分枝杆菌噬菌体如Chettobro和古菌病毒。多个分枝杆菌噬菌体编码的假设蛋白也含有DUF4352结构域，这些蛋白在序列和结构上与Mpr的DUF4352高度保守。体外实验证实，无论是宿主的Mpr蛋白还是噬菌体编码的Gp33^ST和Gp44^FB蛋白，都具有核苷酸水解酶活性，能够水解ATP和GTP。

ppGp的合成及其生理功能

研究首次发现Mpr具有磷酸转移酶活性，能够将ATP的γ-磷酸基团转移给GDP，合成不寻常的鸟苷核苷酸ppGp（GDP-3'-单磷酸）。这种活性在Mpr、Mpr^DUF4352以及噬菌体编码的Gp33^ST和Gp44^FB中均保守存在。然而，令人意外的是，核苷酸水解和ppGp合成活性对于Mpr介导的噬菌体防御并非必需，因为水解缺陷突变体Mpr^T75D和ppGp合成缺陷突变体Mpr^S106D仍保持完整的抗噬菌体能力。

DUF4352作为结构支架在Mpr介导的噬菌体防御中的作用

研究表明DUF4352主要作为结构支架而非催化组件发挥作用。当用噬菌体编码的Gp33^ST替换Mpr中的DUF4352结构域时，产生的嵌合蛋白Gp33c不仅能够定位于细胞膜，还表现出比野生型Mpr更强的抗噬菌体活性。这证明DUF4352的结构框架功能对于Mpr的抗病毒活性至关重要。

DUF4352促进Mpr寡聚化从而介导抗病毒免疫

化学交联和尺寸排阻色谱实验证实Mpr能够形成多种寡聚体状态，包括二聚体、四聚体和更高级的寡聚体。AlphaFold2多聚体建模显示，DUF4352结构域通过Glu155、Asn176和Asp188等残基形成的氢键网络介导蛋白质-蛋白质相互作用，建立寡聚化界面。破坏这些界面残基会削弱Mpr的寡聚化能力并完全消除其抗噬菌体活性。

Mpr寡聚化对GDP浓度的敏感性

研究发现GDP能够特异性引起Mpr寡聚体的解离，而GTP和GMP无此效应。分子动力学模拟表明，GDP能够插入寡聚体界面，占据亚基间相互作用所需的空间，从而破坏界面稳定性。同时，GTP结合于Mpr的膜跨区域，抑制其核酸外切酶活性，这表明Mpr的功能受到核苷酸浓度的精细调控。

Mpr的核酸酶活性对噬菌体防御至关重要

研究证实Mpr的3'→5'DNA外切酶活性是其抗噬菌体功能的核心。核酸酶缺陷突变体Mpr^M2、Mpr^M9和Mpr^ΔLinker虽然能够正常定位于膜，但完全丧失了对D29噬菌体的防御能力。这表明寡聚化的Mpr通过降解入侵的噬菌体基因组来提供免疫保护。

Mpr介导的噬菌体防御是非流产性的且可被噬菌体逃避

与多数流产性感染系统不同，Mpr过表达的细胞在噬菌体感染后仍能保持正常的生长和代谢活性，表明其防御机制是非流产性的。研究人员成功分离出能够逃避Mpr防御的D29噬菌体突变体，全基因组测序发现这些逃逸突变体在次要尾蛋白Gp32^D29基因中均存在Pro185Ser突变，提示Gp32^D29可能是Mpr的识别靶点。

本研究系统阐明了Mpr中DUF4352结构域在抗病毒免疫中的多重功能。DUF4352不仅具有病毒起源，还通过介导Mpr寡聚化为其提供结构框架，这对于Mpr定位于膜并发挥核酸外切酶活性至关重要。研究发现Mpr具有核苷酸水解和磷酸转移酶活性，能够合成新型警报素ppGp，但这种活性与其抗噬菌体功能无关。Mpr的寡聚化状态受GDP浓度调节，而其核酸外切酶活性则受GTP抑制，体现了精细的反馈调控机制。

最重要的是，这项工作揭示了一种独特的非流产性防御策略：宿主细菌重新利用了噬菌体编码的DUF4352结构域，通过寡聚化激活膜相关的序列非特异性核酸外切酶活性，直接降解入侵的噬菌体基因组，同时保证感染细胞的存活。这种防御机制不仅丰富了我们对细菌-噬菌体共进化的理解，也为开发新型抗菌策略提供了理论依据。