不同氧化应激水平对鸭肠上皮细胞来源的细胞外囊泡分泌特性及蛋白质成分分析的影响

《Poultry Science》：Impact of varying oxidative stress levels on the secretion characteristics and protein cargo profiling of extracellular vesicles derived from duck intestinal epithelial cells

氧化应激剂量依赖性改变鸭肠道上皮细胞分泌外泌体及蛋白组学特征，低中浓度刺激分泌并富集RNA代谢、热休克蛋白等分子，高浓度抑制分泌并导致屏障蛋白表达下调。

　　本研究探讨了氧化应激对鸭子肠道上皮细胞（Intestinal Epithelial Cells, IECs）释放的细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）分泌及蛋白载荷的影响。研究团队通过实验分析发现，氧化应激对IECs的细胞活力和肠道屏障功能产生剂量依赖性影响。在低至中等浓度的过氧化氢（Hydrogen Peroxide, H?O?）刺激下，IECs的细胞活力略有下降，同时与肠道屏障功能和氧化应激反应相关的基因表达模式受到抑制。然而，值得注意的是，低到中等浓度的H?O?反而促进了EV的分泌，而高浓度则显著抑制了EV的释放。这种分泌模式的变化表明，EV在应对氧化应激时可能具有不同的调控机制，具体取决于氧化应激的程度。

### 氧化应激对IECs的影响

在实验中，研究人员采用不同浓度的H?O?（0、50、100和200 μmol/L）对IECs进行处理，并通过细胞活力检测、基因表达分析和EV分离等手段，系统地评估了氧化应激对IECs的影响。结果显示，随着H?O?浓度的增加，细胞活力呈现逐步下降的趋势。虽然50 μmol/L的H?O?处理对细胞活力没有显著影响，但100和200 μmol/L的处理则显著降低了细胞的存活率。此外，与肠道屏障功能相关的基因表达，如ZO-1、Claudin-1和Occludin，也呈现出浓度依赖性的下调趋势，表明氧化应激对肠道屏障的破坏作用随剂量增加而增强。

同时，与氧化应激反应相关的基因表达也受到了影响。Nrf2和HO-1的表达在50和100 μmol/L的处理下均有所降低，但在200 μmol/L的处理下则恢复至基线水平。这一现象表明，细胞在面对较高浓度的氧化应激时，可能通过激活某些保护性机制来维持自身的抗氧化能力。然而，即使在高浓度处理下，这种激活仍不足以完全抵消氧化应激带来的损伤，导致细胞存活率和肠道屏障功能的持续下降。

### EV的分离与表征

为了进一步研究氧化应激对EV的影响，研究人员采用标准的差速超速离心法对不同处理组的细胞培养上清液进行EV分离。通过透射电镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）和纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA），研究人员确认了EV的形态特征和大小分布。TEM图像显示，所有处理组均形成了典型的杯状结构，而NTA分析则表明，EV的大小主要集中在90至400纳米之间。此外，低至中等浓度的H?O?处理显著增加了EV的分泌量，而高浓度处理则明显抑制了EV的释放。这种EV分泌量的变化可能反映了细胞在不同氧化应激水平下的适应性反应。

### EV蛋白载荷的分析

为了深入理解EV在氧化应激下的蛋白组成变化，研究人员采用了4D无标记蛋白质组学技术，结合蛋白质组数据的分析，揭示了EV在不同处理条件下的蛋白表达差异。结果显示，与对照组相比，低浓度（EV-L）和中浓度（EV-M）处理组的EV分别出现了55和102个差异表达蛋白（Differentially Expressed Proteins, DEPs），而高浓度处理组（EV-H）则出现了212个DEPs。其中，EV-L和EV-M组的DEPs主要涉及RNA代谢、红ox平衡、蛋白质折叠和内质网应激等过程，而EV-H组的DEPs则呈现出更广泛的下调趋势。

通过基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）的富集分析，研究人员进一步明确了这些DEPs的功能特性。GO分析表明，EV-L组的DEPs主要参与RNA加工和剪接、线粒体功能以及红ox调控相关的过程。KEGG分析则揭示了EV-L组的DEPs在多个关键通路中的富集，包括鞘脂代谢、ATP依赖性蛋白降解和紧密连接通路等。相比之下，EV-M组的DEPs则主要涉及蛋白质折叠、内质网应激以及MAPK和NOD样受体信号通路等。这些发现表明，EV的蛋白载荷在不同氧化应激水平下呈现出显著的功能差异，可能反映了细胞在不同应激条件下的适应性策略。

### 蛋白质互作网络分析

为了进一步探索这些DEPs之间的相互作用，研究人员构建了蛋白质互作网络（Protein-Protein Interaction, PPI）。结果显示，不同处理组的EV蛋白形成了独特的互作模式。例如，在EV-L组中，PDIA3、TRAP1和PGK1等关键蛋白形成了核心网络，这些蛋白在红ox稳态、能量代谢和RNA加工中发挥重要作用。而在EV-M组中，HSPA5、CALR和RPL23A等蛋白则构成了一个更为复杂的网络，这些蛋白可能参与内质网质量控制和翻译缓冲。这些互作网络的变化提示，EV的蛋白组成可能在氧化应激下经历了显著的结构重组，从而影响其在肠道微环境中的功能。

### 转录因子预测与调控机制

为了进一步揭示这些DEPs的上游调控机制，研究人员通过转录因子（Transcription Factor, TF）富集分析，识别了多个可能参与氧化应激响应的转录因子。例如，在EV-L组中，XBP1、SP1和BHLHE40被预测为关键的调控因子，它们可能通过调控特定的基因表达，影响EV的蛋白组成和功能。XBP1是内质网应激（Unfolded Protein Response, UPR）的核心组成部分，其调控的基因可能涉及蛋白质折叠和氧化防御。SP1则广泛参与EV的生物发生和抗氧化基因的调控，而BHLHE40则在应激条件下的昼夜节律和炎症调控中发挥作用。

这些转录因子的富集分析表明，EV的蛋白组成变化可能部分由应激响应的转录调控网络所驱动。然而，这些调控机制是否适用于其他类型的上皮细胞或不同的氧化应激模型，仍需进一步研究。此外，研究人员还发现，某些DEPs如FABP5在高浓度H?O?处理下显著上调，这可能与脂质信号传导和膜重塑有关。这些蛋白的上调可能反映了细胞在应对氧化应激时的一种补偿性代谢反应，以维持脂质平衡或向干细胞微环境传递生物活性脂质。

### 潜在的机制与应用前景

研究还发现，某些关键蛋白如HSP90AB1、CALR和PDIA3在EV中表达水平显著下降，这可能削弱了EV在应激条件下的细胞保护功能。HSPs（如Hsp70和Hsp90）是细胞在应对氧化和内质网应激时的重要分子伴侣，其表达水平的下降可能意味着EV在应激条件下的保护性作用被削弱。此外，研究还发现，FABP5的上调可能有助于细胞在应激条件下维持脂质稳态，并通过旁分泌信号调控受体细胞的代谢功能。

这些发现为理解EV在应激条件下的功能变化提供了新的视角，并揭示了潜在的调控机制。例如，XBP1可能通过调控G6PD、HSP90AB1和ACTG1的表达，影响EV的红ox缓冲能力和细胞骨架稳定性。SP1和BHLHE40则可能通过调控PPIA的表达，进一步影响EV在肠道微环境中的功能。这些转录因子的调控作用可能为开发针对EV的抗氧化干预策略提供了理论支持。

### 技术局限与未来研究方向

尽管本研究提供了关于EV在氧化应激下的功能变化和调控机制的详细信息，但仍存在一些技术局限。例如，在高浓度H?O?处理后，研究人员未对EV进行特定的对照处理，以排除直接氧化剂对EV的潜在影响。由于氧化应激可能引起膜脂质和蛋白的氧化修饰，进而影响EV的完整性和稳定性，因此这些结果需要谨慎解读。未来的研究可以考虑在EV收集前使用催化酶（如过氧化氢酶）去除残留的氧化剂，并引入内标物和完整性控制以区分直接氧化效应与分泌驱动的变化。

此外，虽然本研究已经识别了一些关键的DEPs和转录因子，但这些调控机制是否具有普遍性仍需进一步验证。未来可以通过转录因子扰动实验结合EV蛋白质组学分析，进一步探讨这些调控因子在不同上皮细胞类型或氧化应激模型中的作用。同时，也可以通过功能实验，评估这些DEPs对受体干细胞的潜在影响，从而为改善肠道健康和提高家禽生产效率提供新的思路。

综上所述，本研究揭示了氧化应激对鸭子肠道上皮细胞分泌EV及其蛋白载荷的复杂影响。这些发现不仅有助于理解EV在肠道微环境中的功能变化，还为开发基于EV的抗氧化干预策略提供了理论支持。未来的研究应进一步探讨这些调控机制的普遍性，并通过功能实验验证其在实际生产中的应用潜力。