基于p54表位的核链霉亲和素桥接扩增ELISA方法的开发，用于高灵敏度检测非洲猪瘟病毒抗体

《Veterinary Immunology and Immunopathology》：Development of a Core Streptavidin-Bridging Amplified ELISA Based on p54 Epitope for High-Sensitivity Detection of African Swine Fever Virus Antibodies

非洲猪瘟抗体检测新方法：本研究开发了一种基于核心链链霉蛋白A（cSA）的间接ELISA方法，利用p54蛋白保守抗原表位（60-79位氨基酸）结合cSA固定化系统，显著提升检测灵敏度（达1:1600稀释度）和特异性，OD450值较商用试剂盒提高0.22-0.28，ROC分析显示95.5%敏感性和96.2%特异性，为早期诊断提供有效工具。

　　非洲猪瘟病毒（ASFV）是一种对猪具有高度传染性和致死性的病原体，它引起的疾病在全球范围内造成了巨大的经济损失。由于 ASFV 的高致病性，早期检测对于控制疫情的传播至关重要。尽管基于抗原表位的间接酶联免疫吸附测定（ELISA）在检测灵敏度方面表现出色，但传统方法中抗原表位在 ELISA 板上的吸附可能会干扰抗体的识别过程。因此，本研究提出了一种新的 ELISA 方法，通过将识别出的 p54 抗原表位整合到基于核心生物素化（cSA）的固定系统中，以提高 ASFV 抗体检测的效率。

在研究过程中，我们利用针对重组 p54 蛋白（GST-rp54）的单克隆抗体（6G9 mAb）来识别 p54 中的保守抗原表位。通过实验确认，6G9 mAb 能够特异性地识别 ASFV 阳性血清。进一步分析发现，p54 蛋白中的一个高度保守的线性表位，位于氨基酸 60 到 79 之间（A60AIEEEDIQFINPYQDQQQWV79；p5460–79），是 6G9 mAb 的结合区域。将生物素化修饰的 p54 表位（biotin-PEG4-p5460–79）通过 cSA 固定在 ELISA 板上，显著提高了免疫反应的强度。实验结果显示，6G9 mAb 在 1:800 稀释度下的 OD??? 值增加了 0.22，而 ASFV 阳性血清在 1:400 稀释度下的 OD??? 值增加了 0.28，表明该方法在灵敏度方面具有显著优势。

在优化关键检测参数后，我们建立了一种基于 cSA 的间接 ELISA 方法，使用 p5460–79 表位（cSA-p5460–79-inELISA）。该方法在重复性（变异系数为 3.29–8.76%）和特异性方面表现出色，对古典猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒 2 型（PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（PRV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪丁型冠状病毒（PDCoV）的抗血清均无交叉反应。此外，该方法的灵敏度也得到了显著提升，能够检测 ASFV 阳性血清稀释至 1:1600（OD??? > 0.43），优于市场上现有的 ELISA 试剂盒（检测限为 1:400）。通过受试者工作特征（ROC）分析，该方法在已知状态的样本中（n = 100）显示出 95.5% 的灵敏度和 96.2% 的特异性，表明其在 ASFV 抗体检测中的有效性。

非洲猪瘟（ASF）是一种由 ASFV 引起的、对猪具有高度传染性且经济影响严重的疾病。 ASF 的特征包括高热和内出血，其致病率和死亡率可高达 100%，对全球养猪业造成毁灭性打击。因此， ASF 被世界动物卫生组织（WOAH）列为必须报告的动物疾病。 ASF 最初于 1921 年在肯尼亚被发现，随后传播至葡萄牙（1960 年代）、南美洲（1970 年代）以及格鲁吉亚（2007 年），从那里迅速扩散至俄罗斯和东欧地区。 2018 年， ASF 首次在中国被检测到，引发了多个省份的疫情爆发。尽管已有大量研究致力于开发疫苗和治疗方案，但目前的防控措施仍不足以有效遏制 ASF 的传播，因此准确和早期的诊断成为控制疫情的关键。

ELISA 是 WOAH 推荐的 ASF 检测最常用的方法之一。持续创新 ELISA 技术仍然是全球研究的重点。传统的 ELISA 方法通常使用病毒蛋白作为诊断抗原，但这些蛋白在原核表达系统中容易形成包涵体，而在真核表达系统中则面临较高的生产和纯化成本。抗原表位作为替代方案，能够提供更精确和高效的检测方式，克服了全长蛋白的局限性，提高了抗体结合区域的可接近性。然而，大多数抗原表位是短的线性肽段，由于静电、亲水或疏水相互作用，它们可能会在 ELISA 板表面发生构象变化，导致“平躺”或“蜷曲”，从而限制了有效抗体的识别。

生物素-链霉亲和素系统提供了一种高效的生物分子放大平台。生物素化肽段能够强烈结合链霉亲和素（SA），使其一端固定在 SA 表面，另一端保持自由，从而提高抗体识别效率。核心链霉亲和素（cSA）是一种截短形式，由野生型链霉亲和素的 16–133 个残基组成，保留了完整的生物素结合能力，同时相较于全长蛋白具有更高的稳定性和溶解性，以及更强的抗聚集能力。 ASFV 的 p54 蛋白由 E183L 基因编码，能够诱导强烈的体液免疫反应。抗 p54 抗体在感染早期即可出现，并在数周内持续存在，这使得 p54 成为理想的抗原候选物。因此，结合保守的 p54 抗原表位与 cSA 作为固定支架，我们提出了一种用于早期 ASFV 抗体检测的敏感间接 ELISA 方法。

在本研究中，我们使用来源于重组 ASFV p54 的单克隆抗体来识别保守的抗原表位。随后，我们通过将 cSA 与生物素化修饰的 p54 表位结合，开发了一种 ASFV 抗体检测方法。该方法在重复性、特异性和灵敏度方面进行了优化，并与商业试剂盒进行了比较，以评估其诊断性能。本研究建立了一种基于 cSA 的新型 ELISA 平台，用于 ASFV 抗体检测，结合了高灵敏度和早期诊断能力。

抗原表位是抗原表面的特定结构，作为生物活性区域，能够触发宿主的免疫反应，并导致特定抗体或免疫性淋巴细胞的产生。对这些表位的表征对于理解病毒诱导的免疫反应和推动抗病毒诊断策略至关重要。 ASFV 的 p54 蛋白在不同病毒株中高度保守，是病毒感染和免疫逃逸的关键因子。通过将 p54 的保守表位与 cSA 结合，我们不仅提高了抗体结合的效率，还增强了检测的灵敏度，为 ASFV 的早期诊断提供了新的工具和方法。

本研究的实验涉及动物，所有动物实验均获得了浙江省农业与食品大学科技部门的动物实验伦理委员会的批准（批准号：ZAFUAC202466），并符合《实验动物管理规定》。研究还得到了浙江省自然科学基金（LQ23C180006）、国家自然科学基金（32402858）以及国家自然科学基金区域创新与发展战略联合基金（项目编号：U23A20236）的支持。研究团队成员在论文撰写过程中，各自承担了不同的任务，包括实验设计、数据分析、方法开发、实验实施和论文撰写等。

在研究过程中，我们使用了多种细胞系和抗体。例如，骨髓瘤 SP2/0 细胞和 HEK-293T 细胞分别在 RPMI-1640 和 DMEM 培养基中培养，环境为 37°C、5% CO? 和 95% 空气的湿度条件。 SP2/0 骨髓瘤和杂交瘤细胞在 DMEM 培养基中培养，其中添加了 20% 的胎牛血清（FBS；Gibco，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德），而 HEK-293T 细胞则在 DMEM 培养基中培养，其中添加了 10% 的 FBS。此外，我们还使用了多种病毒，包括古典猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒 2 型（PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等，用于验证新 ELISA 方法的特异性。

在 ASFV 抗体检测方法的开发过程中，我们首先通过表达和纯化 GST 标记的 p54 蛋白（GST-rp54）来确认其抗原性。实验结果显示， GST-rp54 在 1:800 稀释度下与 ASFV 阳性血清发生了特异性反应，确认了其作为抗原的适用性。随后，我们利用纯化的 GST-rp54 免疫 6 周大的雌性 BALB/c 小鼠，生成了分泌 p54 特异性抗体的杂交瘤细胞株。通过 ELISA 方法筛选，我们获得了单克隆抗体 6G9，该抗体能够特异性识别 ASFV 阳性血清中的 p54 表位。

本研究的成果为 ASF 的早期诊断提供了一种新的工具。通过将 p54 的保守表位与 cSA 结合，我们不仅提高了抗体结合的效率，还增强了检测的灵敏度。此外，该方法在重复性和特异性方面表现出色，对其他猪病病毒的抗血清均无交叉反应，表明其在实际应用中的可靠性。这一创新方法的开发，为 ASFV 抗体检测提供了更高的准确性和效率，有助于提高 ASF 的防控能力。通过将生物素化修饰的 p54 表位固定在 ELISA 板上，我们能够更有效地暴露抗体结合区域，从而提高检测的灵敏度和特异性。这一策略不仅适用于 ASFV 的检测，还可能为其他病原体的诊断提供借鉴。

在 ASFV 的检测中，我们发现该方法的灵敏度显著优于现有的商业 ELISA 试剂盒。例如，该方法能够检测 ASFV 阳性血清稀释至 1:1600，而商业试剂盒的检测限为 1:400。这一结果表明，基于 p54 表位的 ELISA 方法在检测能力方面具有显著优势。此外，通过 ROC 分析，我们发现该方法在已知状态的样本中（n = 100）显示出 95.5% 的灵敏度和 96.2% 的特异性，进一步验证了其在实际应用中的有效性。

本研究的创新点在于利用 cSA 作为固定支架，将 p54 的保守表位结合到 ELISA 板上，从而提高抗体结合的效率和检测的灵敏度。这一方法不仅提高了 ASFV 抗体检测的准确性，还降低了检测成本，提高了检测的可行性。此外，该方法在重复性和特异性方面表现出色，对其他猪病病毒的抗血清均无交叉反应，表明其在实际应用中的可靠性。这一成果为 ASF 的防控提供了新的思路和方法，有助于提高 ASF 的早期诊断能力，从而有效遏制疫情的传播。

通过将生物素化修饰的 p54 表位固定在 ELISA 板上，我们能够更有效地暴露抗体结合区域，从而提高检测的灵敏度和特异性。这一方法不仅适用于 ASFV 的检测，还可能为其他病原体的诊断提供借鉴。在 ASFV 的检测中，我们发现该方法能够显著提高检测的灵敏度，同时保持较高的特异性，表明其在实际应用中的有效性。此外，该方法在重复性方面也表现出色，变异系数在 3.29–8.76% 之间，表明其在不同实验条件下的稳定性。

在 ASFV 的检测中，我们发现该方法能够显著提高检测的灵敏度，同时保持较高的特异性，表明其在实际应用中的有效性。此外，该方法在重复性方面也表现出色，变异系数在 3.29–8.76% 之间，表明其在不同实验条件下的稳定性。通过 ROC 分析，我们发现该方法在已知状态的样本中（n = 100）显示出 95.5% 的灵敏度和 96.2% 的特异性，进一步验证了其在实际应用中的有效性。

本研究的成果不仅为 ASF 的早期诊断提供了一种新的工具，还为其他病原体的诊断提供了借鉴。通过将 p54 的保守表位与 cSA 结合，我们能够提高抗体结合的效率，从而增强检测的灵敏度和特异性。此外，该方法在重复性和特异性方面表现出色，对其他猪病病毒的抗血清均无交叉反应，表明其在实际应用中的可靠性。这一成果为 ASF 的防控提供了新的思路和方法，有助于提高 ASF 的早期诊断能力，从而有效遏制疫情的传播。

综上所述，本研究开发了一种基于 p54 抗原表位的新型间接 ELISA 方法，该方法在检测灵敏度、特异性和重复性方面均表现出色，为 ASF 的早期诊断提供了有效的工具。通过将生物素化修饰的 p54 表位固定在 ELISA 板上，我们能够提高抗体结合的效率，从而增强检测的灵敏度和特异性。这一方法不仅适用于 ASFV 的检测，还可能为其他病原体的诊断提供借鉴。通过优化关键检测参数，我们建立了基于 cSA 的间接 ELISA 方法，该方法在实际应用中具有较高的可靠性，能够有效提高 ASF 的防控能力。