《Veterinary Microbiology》：Identification of Transiently Produced IgG Linear Epitopes in Senecavirus A for Differentiating Infected from Vaccinated Animals
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病毒抗体动态监测辅助表位发现策略用于口蹄疫病毒A型疫苗与感染鉴别诊断研究，成功识别VP2-15等4个线性B细胞表位，开发出特异性达90.6%的肽探针联合诊断试剂盒，为口蹄疫病毒A型防控提供新工具。
兰洋|樊丹蒙|周汉荣|马宏伟|安同庆|姜宁|王海伟|蔡学辉
中国科学院苏州纳米技术与纳米生物研究所纳米生物医学分部，中国苏州215123
摘要
区分感染动物和接种疫苗的动物（DIVA）对于疾病根除和新发感染的监测至关重要。Senecavirus A（SVA）会导致猪出现水泡性疾病和新生儿死亡，其在临床上与口蹄疫病毒（FMDV）无法区分，对养猪业构成了重大经济风险。因此，迫切需要一种可靠的DIVA诊断方法来准确检测SVA。在本研究中，我们采用了IgG血清动态曲线辅助表位发现（IsDAED）方法，利用肽微阵列来识别SVA结构蛋白上短暂产生的IgG（TPI）相关线性B细胞表位。VP2-15被确定为多个感染样本中共有的主要线性表位，表现出特征性的短暂抗体反应。此外，还鉴定出了特定于样本的表位VP2-4、VP3-12和VP1-24。接种疫苗试验表明，VP2-15在加强免疫后7-42天内具有诊断窗口期，而DIVA窗口期则超过60天。灭活疫苗免疫后的挑战实验确认VP2-15能够可靠地指示新感染。病毒中和试验（VNT）和体外阻断实验显示，VP2-15肽可以部分阻断中和抗体对SVA的中和作用，但它不能在猪体内诱导中和抗体。基于VP2-15、VP2-4、VP3-12和VP1-24肽探针组合的诊断试剂盒在临床样本中表现出高灵敏度（97.9%）和特异性（90.6%），且与FMDV无交叉反应。总体而言，本研究中鉴定出的抗原表位通过TPI检测实现了DIVA，为SVA监测提供了有价值的工具，并推动了控制策略的发展以及我们对宿主-病毒相互作用的理解。
引言
Senecavirus A（SVA）是一种无包膜的单链正链RNA病毒，是Picornaviridae科中Senecavirus属的唯一成员。其基因组编码四种结构蛋白：VP1、VP2、VP3和VP4（Hales等人，2008年）。SVA感染可导致猪的特发性水泡性疾病（PIVD）和流行性短暂新生儿死亡（ETNL）（Leme等人，2016年；Vannucci等人，2015年）。自2014-2015年在巴西和美国爆发以来，SVA迅速传播到多个国家和地区，对养猪业健康管理构成了重大挑战。临床上，SVA感染的猪通常在鼻部和冠状带出现水泡性病变，伴有溃疡、跛行和发热症状，这些症状与其他水泡性疾病（如口蹄疫病毒FMDV）引起的症状无法区分（Houston等人，2020年）。SVA可以感染所有年龄段的猪，7天以下的仔猪死亡率可达15-30%（Gimenez-Lirola等人，2016年）。据报道，美国母猪中的血清阳性率为17.3%（Preis等人，2022年），凸显了SVA对养猪业的重大经济损失。此外，无症状和持续性感染增加了病毒脱落和重新出现的风险，进一步复杂化了疾病控制工作（Bracht等人，2016年；Houston等人，2020年；Maggioli等人，2019年）。因此，系统研究SVA感染后的宿主免疫反应并开发准确的诊断工具以识别SVA感染动物至关重要。
疫苗接种被认为是预防和控制SVA传播最有效的策略。灭活疫苗、减毒活疫苗和类病毒颗粒（VLP）疫苗在猪体内显示出良好的免疫原性和保护效果（Mu等人，2020年；Sharma等人，2019年；Yang等人，2018年）。区分感染动物和接种疫苗的动物（DIVA）对于病毒根除计划至关重要。鉴于SVA疫苗开发的进展，迫切需要建立一种高度特异和高效的诊断方法，以区分感染动物和接种疫苗的动物。这样的方法将能够准确评估SVA感染状态，并为疾病控制和最终根除提供重要工具。传统的DIVA方法涉及开发标记疫苗和相应的血清学检测，但往往受到较长开发时间和有限适用性的限制（Aebischer等人，2013年；Gomez-Sebastian等人，2008年）。我们之前的工作建立了一种基于肽微阵列技术的新颖高效DIVA诊断平台，该方法不依赖于标记疫苗的开发。相反，它通过监测接种疫苗动物的IgG血清动态来识别诊断肽表位，从而捕捉免疫过程中的短暂抗体反应——这种方法称为IgG血清动态曲线辅助表位发现（IsDAED）。这种方法已成功应用于小反刍动物瘟病毒（PPRV）和猪圆环病毒2型（PCV2）（Chen等人，2022年；Xue等人，2020年）。
在本研究中，我们旨在全面识别SVA所有结构蛋白上的B细胞表位，以开发有效的诊断和DIVA策略，并评估IsDAED方法的更广泛适用性。首先，我们使用肽微阵列结合IgG血清动态分析，在感染和接种疫苗的猪的纵向队列中识别主要表位区域，并设计了一种DIVA方法。然后，我们通过接种疫苗后的挑战实验确认了这种DIVA方法的有效性和实用性。总体而言，本研究为SVA与宿主免疫反应之间的相互作用提供了新的见解，为改进诊断工具和DIVA方法奠定了基础，并有助于未来SVA的预防和控制工作。
部分摘录
伦理声明
所有动物实验均按照中华人民共和国科学技术部发布的《实验动物护理和使用指南》进行。猪的疫苗接种和挑战研究在哈尔滨兽医研究所动物实验伦理委员会的监督下，在生物安全等级2（BSL-2）的动物设施中进行。
利用纵向挑战队列的血清鉴定SVA的免疫原性线性表位
我们之前使用PCV2作为模型开发了IsDAED方法，以基于免疫原性分析识别线性B细胞表位（Chen等人，2022年）。为了评估IsDAED方法的通用性，我们选择了结构更为复杂的SVA病毒，并系统地识别了其四种结构蛋白上的线性B细胞表位。我们使用从三只实验感染的猪中收集的血清建立了纵向挑战队列。
讨论
在我们之前的研究中，我们开发了一种基于血清学的表位识别策略，称为IsDAED，使用PCV2作为模型病毒。该方法识别出五个高免疫原性的线性B细胞表位，有效区分了感染动物和接种疫苗的动物（Chen等人，2022年）。类似的应用在PPRV中也得到了四个具有可比区分性能的表位，允许通过血清学方法区分感染和接种（Xue等人，2020年）。我们应用了这种方法
资助
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号32002249，资助给FM）的资助。
CRediT作者贡献声明
蔡学辉：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、概念构思。王海伟：撰写——审稿与编辑、可视化、监督、资源管理、项目管理、概念构思。樊丹蒙：撰写——初稿撰写、方法学研究、资金申请、数据分析、概念构思。兰洋：撰写——初稿撰写、可视化、方法学研究、数据分析、数据管理、概念构思。姜宁：
利益冲突
作者声明本研究在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。
致谢
透射电子显微镜（TEM）分析由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的电子显微镜中心完成。
作者贡献
L.Y.、F.M.、H.Z.和T.A.负责进行动物实验和收集血清样本。血清学检测由H.Z.和T.A.完成。数据分析和手稿起草由L.Y.、F.M.、H.M.和N.J.参与。本研究由L.Y.、F.M.、H.W.和X.C.共同构思并撰写手稿。
