通过细胞纳米孔技术高效扩大EV-AAV（电穿孔腺相关病毒）的生产规模，用于家族性高胆固醇血症的治疗

《Journal of Extracellular Vesicles》：Efficient Scaling up EV-AAVs Production via Cellular Nanoporation for Familial Hypercholesterolaemia Therapy

基因治疗中，AAV介导的外泌体封装病毒（EV-AAV）通过减少抗体中和和肝毒性提高疗效。采用细胞纳米孔技术（CNP）显著提升EV-AAV产量达11倍，并在存在1:200中和抗体的LDLR缺陷小鼠模型中，半剂量EV-AAV恢复肝LDLR表达效果优于传统AAV，且血清AST/ALT水平与空白对照组无差异，克服剂量依赖性肝毒性。分隔符：

　　在现代医学领域，基因治疗正逐步成为一种突破性疗法，尤其在治疗一些传统手段难以根治的遗传性疾病方面展现出巨大潜力。然而，尽管其疗效显著，基于腺相关病毒（AAV）的基因治疗仍然面临诸多挑战，其中最突出的包括免疫系统对病毒的中和反应以及高剂量治疗可能引发的肝毒性。这些问题严重限制了AAV在临床中的广泛应用，特别是在那些已存在抗体的患者群体中。因此，寻找一种既能提高治疗效果又能降低安全风险的新型载体成为当前研究的重点。本研究提出了一种创新性的解决方案，即利用细胞纳米穿孔（CNP）技术，生产一种由细胞外囊泡（EVs）包裹的AAV载体——EV-AAVs。这种技术不仅显著提升了EV-AAVs的产量，还有效缓解了免疫排斥和肝毒性问题，为基因治疗开辟了新的路径。

### 基因治疗的挑战与前景

基因治疗是一种通过将正常基因导入患者体内，以替代或修复有缺陷基因的疗法。在众多基因治疗载体中，AAV因其低免疫原性、长滞留时间和高效的基因传递能力而成为首选。然而，AAV在临床应用中仍然存在两大主要问题：一是宿主体内已有的中和抗体（NAbs）可能显著降低其治疗效果；二是高剂量的AAV可能引发严重的肝毒性反应，甚至危及生命。这些问题在某些特定疾病中尤为突出，例如家族性高胆固醇血症（FH），其中患者体内存在大量针对AAV的中和抗体，且肝脏是主要的靶器官，容易受到病毒的毒性影响。

为了解决这些问题，研究人员尝试了多种策略，包括使用免疫抑制剂、优化AAV衣壳结构等。然而，这些方法要么效果有限，要么存在副作用，无法从根本上解决免疫中和和毒性问题。因此，探索一种既能有效避免免疫识别，又能减少肝毒性的新型载体成为当务之急。

### EV-AAVs的特性与优势

细胞外囊泡（EVs）是一类由细胞自然分泌的微小脂质结构，具有天然的生物相容性和较低的免疫原性。研究表明，EVs可以自然地包裹AAV，形成EV-AAVs。这种包裹不仅保护了AAV免受免疫系统的攻击，还能提高其在体内的稳定性和传递效率。此外，EVs具有穿透生理屏障的能力，使其成为一种理想的基因传递工具。然而，目前的EV-AAVs生产方法存在效率低下、成本高昂的问题，限制了其在临床中的应用。

为了解决这一瓶颈，本研究引入了一种名为细胞纳米穿孔（CNP）的新技术。该技术通过在细胞膜上形成瞬时纳米孔，引发细胞膜的局部破坏，从而促进EV的产生。CNP还能通过局部加热诱导热休克蛋白（HSPs）的表达，提升细胞内钙离子浓度，这些效应共同作用，显著增加了EV的产量。与传统方法相比，CNP能够将EV-AAVs的产量提升约11倍，为大规模生产提供了可行的路径。

### CNP技术在EV-AAVs生产中的应用

在本研究中，研究人员利用CNP技术优化了EV-AAVs的生产流程。具体而言，将HEK293T细胞均匀铺在CNP系统中，并通过聚乙烯亚胺（PEI）进行双质粒转染。转染后，根据不同的时间点（0、12、24、48和56小时）对细胞进行电刺激。结果表明，CNP在转染后48小时进行刺激时，能够实现最高的EV-AAVs产量，且这种产量的提升主要源于EV的增加，而非病毒包装效率的提高。这表明CNP不仅能够促进EV的产生，还能有效提高病毒的包裹效率。

此外，研究还通过一系列实验验证了CNP生成的EV-AAVs的结构和功能。通过透射电镜（TEM）和免疫金标记技术，研究人员确认了EV-AAVs的形态与天然EV相似，并且AAV被成功包裹在EV内部。Western blot分析进一步表明，EV标志蛋白如TSG101、CD63和CD81在CNP处理后的EV中表达显著增强，说明CNP确实促进了EV的生成。同时，EV-AAVs的粒径分布与天然EV相近，且其表面电位未发生明显变化，进一步验证了其生物相容性和稳定性。

### EV-AAVs在体内的表现与治疗效果

为了评估EV-AAVs在体内的表现，研究人员对C57BL/6小鼠进行了实验。将EV-AAV-Fluc与常规AAV-Fluc在相同剂量下进行比较，发现EV-AAV-Fluc在肝脏中的转染效率显著高于AAV-Fluc，尤其是在第二次注射时，其转染效率甚至保持了2.3倍的提升。这表明EV-AAVs能够有效避免中和抗体的影响，从而在多次给药中维持稳定的治疗效果。

进一步的研究聚焦于EV-AAV-LDLR在治疗家族性高胆固醇血症模型中的效果。研究人员将LDLR基因缺失的小鼠（LDLR?/?）喂食高脂肪饮食11周后，通过尾静脉注射给予EV-AAV-LDLR或常规AAV-LDLR。结果显示，即使在存在中和抗体的情况下，EV-AAV-LDLR也能显著恢复肝脏中的LDLR表达，并有效改善血脂水平。相比之下，常规AAV-LDLR在第二次注射时表现出明显的转染效率下降，而EV-AAV-LDLR则能够维持较高的治疗效果。

### 安全性评估与临床意义

除了疗效，安全性也是基因治疗的关键考量因素。研究人员对EV-AAV进行了高剂量（6e12 vg）的评估，发现其对肝脏的损伤显著低于常规AAV。通过H&E染色和MPO、CD68染色，研究人员观察到EV-AAV治疗的小鼠肝脏组织中炎症细胞浸润较少，肝细胞形态正常。此外，血清中的AST和ALT水平在EV-AAV治疗后恢复至接近正常范围，而常规AAV治疗则导致这些指标显著升高，表明EV-AAV具有更低的肝毒性。

在炎症因子方面，EV-AAV治疗的小鼠体内IL-6、IFN-γ、IL-1β和TNF-α等促炎因子的水平也明显低于常规AAV组，进一步证明其在减少炎症反应方面的优势。这些结果不仅验证了EV-AAV在治疗家族性高胆固醇血症中的潜力，也为其他需要长期治疗的遗传性疾病提供了新的思路。

### 未来发展方向与研究意义

尽管本研究取得了显著成果，但EV-AAVs的生产与应用仍面临一些挑战。例如，如何进一步优化CNP参数以实现更高的EV产量，以及如何改进AAV的包装策略以提升其在EV中的封装效率。未来的研究可以围绕这些方面展开，以推动EV-AAVs的临床转化。

此外，EV-AAVs的肝靶向特性使其在治疗家族性高胆固醇血症方面具有独特优势。EVs天然具有对肝脏的亲和力，能够高效地被肝细胞摄取，而无需额外的修饰。这种特性不仅提高了治疗效果，还降低了其他组织的非靶向作用，从而减少了副作用。因此，EV-AAVs在肝病基因治疗中具有广阔的应用前景。

本研究的成果不仅为家族性高胆固醇血症患者提供了新的治疗方案，也为其他依赖肝靶向治疗的遗传性疾病开辟了新的可能性。通过结合CNP技术，EV-AAVs的生产效率得到了显著提升，同时其免疫逃避能力和安全性也得到了充分验证。这一突破为基因治疗领域带来了新的希望，特别是在应对免疫中和和肝毒性等挑战方面。未来，随着技术的不断成熟，EV-AAVs有望成为下一代基因治疗的重要载体，为更多患者带来福音。