早期着床过程中的细胞外囊泡、脂滴与AhR配体：胚胎-母体相互作用的动态机制

《Journal of Extracellular Vesicles》：Extracellular Vesicles, Lipid Droplets and AhR Ligands in Early Implantation: The Dynamics of Embryo-Maternal Crosstalk

外泌体介导的胚胎-子宫内膜对话及其代谢调控机制研究。采用人体外共培养模型和特异性外泌体工具，动态追踪了胚胎和子宫内膜细胞间的外泌体（EV）分泌、摄取与处理。发现激素刺激改变了子宫内膜的分泌谱，刺激型EV（St-EVs）在大小、分泌动态、摄取效率和代谢物负载方面与非刺激型EV（NSt-EVs）显著不同，尤其富含AhR配体（如吲哚衍生物）和能量相关代谢物。AhR抑制增加了球形体（spheroids）与NSt子宫内膜细胞的附着率，提示AhR信号调控子宫内膜微环境。研究还发现脂滴（LDs）的主动分泌与摄取在胚胎着床中起关键作用，EV的快速内化影响线粒体活性和细胞外基质重塑，并在1小时内驱动细胞代谢变化，促进胚胎附着。该研究深化了胚胎-母体EV介导通讯的理解，并为其他生物学情境中双向EV通讯机制研究提供了模型。

　　在人类胚胎发育过程中，细胞间的交流至关重要，它不仅决定了胚胎能否成功着床，还影响着整个妊娠过程的顺利进行。然而，尽管已有大量研究关注胚胎与母体之间的分子对话，但关于细胞外空间在这一过程中所扮演的角色及其动态变化仍然存在诸多未知。特别是在胚胎进入子宫腔之前和之后，母体子宫内膜和胚胎的代谢状态如何相互作用，以及这些代谢变化是否通过细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）进行调控，仍然是一个未解之谜。本文通过构建一种人类体外共培养模型，结合EV特异性工具，对胚胎与子宫内膜细胞之间的EV分泌、摄取及处理过程进行了动态追踪，揭示了细胞外空间在母胎对话中的关键作用。

### 一、母胎对话中的代谢变化与EV动态

在人类的月经周期中，子宫内膜会经历周期性的变化，主要由卵巢分泌的激素调控，如雌激素（estrogen, E2）和孕酮（progesterone, P4）。子宫内膜的受容期（window of implantation, WOI）通常持续约5天，这一阶段对于胚胎的着床至关重要。在这一时期，胚胎和子宫内膜细胞之间的代谢活动发生显著变化，为胚胎的着床和后续发育提供必要的能量支持和生物合成材料。然而，目前的研究大多基于静态时间点采样，无法全面揭示这一过程的动态特性。

为了更深入地理解这一动态过程，研究者采用了一种改进的激素刺激方案，模拟了体内子宫内膜在分泌期（secretory phase）的生理状态。具体而言，RL95-2子宫内膜上皮细胞在体外被雌激素刺激3天后，再加入孕酮，以模拟体内子宫内膜的分泌状态。通过检测特定的分泌期标志物（如PGRMC1和PGRMC2），研究者确认了该激素刺激方案能够有效模拟体内子宫内膜的分泌过程。同时，研究还构建了由人滋养层细胞JAR形成的多细胞三维球体（spheroids），并将其与子宫内膜细胞共培养，以模拟胚胎与子宫内膜之间的早期互动。

研究发现，激素刺激显著改变了子宫内膜细胞的脂滴（lipid droplets, LDs）数量和大小。在刺激后的子宫内膜细胞中，每个细胞含有2-8个LD，且LD面积明显大于未刺激细胞。此外，当胚胎球体与子宫内膜细胞共培养时，刺激细胞分泌的LD被球体迅速摄取，并在短时间内被处理，而未刺激细胞分泌的LD则在2小时内逐渐增加。这表明，子宫内膜在激素刺激下不仅增加了LD的生成，还改变了其分泌和摄取的动态，为胚胎的着床提供了重要的代谢支持。

### 二、EV分泌与摄取的动态变化

细胞外囊泡（EVs）是细胞间信息传递的重要媒介，它们携带多种生物分子，如RNA、蛋白质和脂质，能够影响目标细胞的代谢状态、基因表达和功能。在本研究中，通过使用pHluo_M153R-CD63-mScarlet等EV特异性荧光标记工具，研究者动态监测了EV的分泌和摄取过程。结果表明，当胚胎球体与子宫内膜细胞接触时，EV的分泌和摄取模式发生了显著变化。刺激细胞（St）和未刺激细胞（NSt）之间的EV分泌速率、摄取效率和代谢内容物存在明显差异。

例如，在共培养的前2小时内，刺激细胞的EV分泌速率明显高于未刺激细胞。而在2小时后，未刺激细胞对EV的摄取量反而超过了刺激细胞，这可能与不同细胞类型对EV的摄取机制有关。此外，EV的大小也有所不同，刺激细胞分泌的EV整体比未刺激细胞的EV更大，这可能与其携带的代谢物质种类和数量有关。通过进一步分析，研究者发现刺激细胞分泌的EV中富含与能量代谢相关的代谢物，如α-酮戊二酸（αKG）、异柠檬酸（isocitrate）和琥珀酸（fumarate）等，而未刺激细胞分泌的EV则更多地含有葡萄糖（glucose）和甘油三酯（triglycerides, TGs）。

此外，研究还发现，EV的摄取不仅影响了细胞的代谢状态，还可能通过调控线粒体功能和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑来促进胚胎的着床。例如，当胚胎球体与刺激细胞共培养时，其对EV的摄取显著增加，这可能与线粒体功能的激活有关。线粒体是细胞能量代谢的核心，其膜电位的变化反映了细胞的能量状态。研究者通过使用JC-1染色，发现刺激细胞在接触胚胎球体后，其线粒体膜电位发生了显著变化，表明EV的摄取可能通过调节线粒体功能，影响胚胎的代谢需求和细胞活动。

### 三、EV与AhR信号通路的相互作用

AhR（aryl hydrocarbon receptor）是一种重要的受体，能够响应环境毒素和内源性代谢物。研究表明，AhR信号通路在胚胎着床过程中发挥着关键作用。刺激细胞分泌的EV富含AhR配体，如吲哚类代谢物（indoles）和乙酰吡嗪（acetylpyrazine）。这些配体可能通过激活AhR，调节子宫内膜的代谢状态和免疫反应，从而促进胚胎的着床。

为了进一步验证AhR在胚胎着床中的作用，研究者使用了AhR特异性抑制剂CH-223191，并发现其能够显著增加胚胎球体与未刺激细胞之间的结合。这一结果表明，AhR信号通路在调控胚胎与子宫内膜之间的相互作用中起着关键作用。此外，研究者还发现，某些AhR配体，如吲哚-3-丙酸（IPA），能够促进胚胎球体的早期结合，这可能与它们的抗炎和抗氧化特性有关。然而，值得注意的是，IPA在人体血清中与胚胎着床呈负相关，这提示其在特定条件下可能具有双重作用。

### 四、EV与细胞外基质的相互作用

细胞外基质（ECM）是细胞与细胞外环境相互作用的重要介质，它不仅为细胞提供结构支持，还参与细胞信号传递和代谢调控。研究发现，EV的分泌和摄取能够显著影响ECM的组成和结构。例如，当子宫内膜细胞被刺激后，其对ECM成分（如胶原蛋白I和IV）的黏附能力显著增强，这可能与EV携带的代谢物和信号分子有关。此外，研究者还发现，胚胎球体与子宫内膜细胞之间的相互作用能够改变ECM的重塑过程，使得细胞更容易附着和侵入。

通过使用Millicoat ECM筛选试剂盒，研究者检测了不同条件下ECM成分的黏附情况。结果显示，刺激细胞分泌的EV能够显著增强子宫内膜细胞对胶原蛋白I和IV的黏附能力，而未刺激细胞分泌的EV则对胶原蛋白IV的黏附能力有抑制作用。这表明，EV的分泌不仅影响了细胞的代谢状态，还可能通过调控ECM的组成和结构，促进胚胎的着床。

### 五、EV对线粒体功能和脂滴动态的影响

线粒体是细胞能量代谢的核心，其功能状态直接影响细胞的代谢效率和存活能力。研究发现，EV的摄取能够显著改变线粒体的膜电位和功能。例如，当子宫内膜细胞接触刺激细胞分泌的EV后，其线粒体膜电位显著降低，这可能与细胞能量需求的增加有关。而当胚胎球体接触刺激细胞分泌的EV后，其线粒体膜电位则呈现出先升高后降低的趋势，这可能反映了细胞在处理EV时的能量消耗和重新分配。

此外，研究还发现，EV的摄取能够显著影响脂滴的动态。例如，当刺激细胞分泌的EV被未刺激细胞摄取后，其脂滴数量显著减少，而脂滴的质量则有所增加。这表明，脂滴可能在EV的调控下被快速利用，以满足细胞的能量需求。同时，脂滴的分布位置也发生了变化，刺激细胞分泌的EV能够将脂滴向细胞核方向运输，这可能与脂滴的代谢功能有关。

### 六、EV在母胎对话中的作用机制

EV不仅是代谢物和信号分子的载体，还可能通过调控细胞间的相互作用，影响胚胎的着床和发育。研究者通过多种实验手段，揭示了EV在母胎对话中的多重作用。例如，EV的摄取能够迅速改变细胞的代谢状态，促进线粒体活动和脂滴的动态变化。此外，EV还可能通过影响细胞外基质的组成和结构，增强细胞之间的相互作用，从而促进胚胎的附着和侵入。

值得注意的是，EV的动态变化不仅发生在胚胎进入子宫腔后，还可能在胚胎与子宫内膜的初次接触阶段就开始发挥作用。例如，当胚胎球体与子宫内膜细胞共培养时，其对EV的摄取在1小时内即可显著改变细胞的代谢状态和功能。这种快速的细胞间信号传递机制，可能为胚胎的早期发育提供了重要的支持。

### 七、EV的动态变化与胚胎着床的协调

综上所述，EV在母胎对话中扮演着多重角色，不仅作为代谢物的载体，还通过调控线粒体功能、脂滴动态和细胞外基质重塑，影响胚胎的着床和发育。研究者发现，刺激细胞分泌的EV能够显著改变子宫内膜细胞的代谢状态，使其更有利于胚胎的附着和侵入。而未刺激细胞分泌的EV则可能通过不同的机制，抑制胚胎的着床。

此外，研究还发现，EV的动态变化可能受到多种因素的影响，包括激素刺激、细胞间的相互作用以及EV本身的组成。例如，当胚胎球体与刺激细胞共培养时，其对EV的摄取显著增加，这可能与刺激细胞分泌的EV富含能量相关代谢物有关。同时，EV的摄取还可能通过调控AhR信号通路，影响细胞的代谢和免疫反应，从而促进胚胎的着床。

### 八、研究的意义与未来方向

本研究通过构建一种体外共培养模型，首次动态追踪了胚胎与子宫内膜细胞之间的EV分泌、摄取和处理过程，揭示了EV在母胎对话中的关键作用。研究结果表明，EV不仅是代谢物的载体，还可能通过调控细胞外基质、线粒体功能和脂滴动态，影响胚胎的着床和发育。这些发现为理解胚胎着床的分子机制提供了新的视角，并为未来的临床研究和治疗策略提供了理论依据。

未来的研究可以进一步探索EV在不同生理和病理条件下的动态变化，以及它们如何影响胚胎的发育和母体的免疫反应。此外，还可以通过更精确的标记技术和影像分析方法，揭示EV在细胞内的具体作用机制。例如，使用荧光标记的EV进行实时追踪，或通过高通量代谢组学分析，揭示EV携带的代谢物如何影响细胞的代谢状态和功能。

总之，本研究为理解母胎对话中的EV作用提供了重要的线索，并为未来研究胚胎着床的分子机制和相关疾病的治疗策略奠定了基础。随着对EV研究的深入，我们有望更好地揭示胚胎发育的复杂过程，并为提高人类生育率和妊娠成功率提供新的思路。