VesicleVoyager：在体内筛选能够引导细胞外囊泡定向至组织特异性靶点的表面展示蛋白

《Journal of Extracellular Vesicles》：VesicleVoyager: In Vivo Selection of Surface Displayed Proteins That Direct Extracellular Vesicles to Tissue-Specific Targets

本研究开发了一种基于外泌体（EV）的分子筛选平台，利用EV的自然运输能力，通过表面修饰增强靶向性。在体内多次递送和回收筛选后，成功选择出具有组织特异性递送功能的单克隆抗体。数学分析显示，尽管表型和基因型之间无完美相关性，迭代筛选仍能高效富集目标结合序列，为靶向药物递送提供了创新解决方案。

　　在现代生物医学研究中，精准靶向治疗药物至特定组织和细胞一直是药物递送领域的重要挑战。尽管经过数十年的研究，目前只有不到2%的系统性给药能够成功到达其预期的靶点，这凸显了开发新型靶向策略的紧迫性。为此，科学家们提出了一种基于细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）的新型分子筛选平台，旨在克服传统体外筛选方法的局限性，使靶向分子的选择过程更加贴近实际的生理环境。

EVs作为天然的分子载体，具有独特的生物学特性，能够将生物活性分子在体内传递至不同细胞，同时携带功能性载荷。这些纳米颗粒不仅在细胞间传递蛋白质、核酸和脂质，还在免疫调节、抗原呈递、组织修复、癌症治疗以及神经退行性疾病等多个方面发挥着重要作用。相比于合成脂质和纳米载体，EVs展现出不同的动力学特性、生物分布模式和功能特性，这使得它们成为理想的靶向递送工具。此外，EVs避免了与脂质纳米载体和病毒递送系统相关的毒性和免疫原性问题，从而为生物医学应用提供了更安全的选项。

然而，传统的EV工程方法通常集中在对EV表面进行单个或少量修饰，或者通过体外实验来筛选特定的靶向分子。这些方法虽然在一定程度上提高了EV的靶向能力，但难以在体内实现高效筛选。为了填补这一空白，研究团队开发了一种称为VesicleVoyager的新型EV显示库筛选平台，该平台利用EV的天然特性，在体内环境中进行迭代筛选，以识别能够特异性靶向组织的分子。通过将编码靶向蛋白的DNA封装在EV内部，并在EV表面展示这些蛋白，该平台实现了对显示蛋白和封装DNA之间关系的动态追踪，从而能够筛选出具有高效靶向能力的分子。

VesicleVoyager平台的核心在于其能够在体外和体内环境中同时进行筛选和优化。这一方法的关键创新在于，首先通过一种称为SLiCE的技术高效构建了重组DNA库，随后将这些DNA引入哺乳动物细胞，从而在EV表面展示特定的单体蛋白（monobody）。通过多次筛选和扩增，研究团队成功地在不同组织中筛选出具有高度特异性结合能力的单体蛋白。这种在体内环境中的筛选方法不仅能够考虑到复杂的组织结构、多样的翻译后修饰和复杂的分子相互作用，还能够通过迭代选择优化分子的结合特性和递送效率。

在实验验证方面，研究团队首先通过体外筛选验证了平台的有效性。他们使用A431细胞作为模型，对展示不同单体蛋白的EV进行了筛选，并通过qPCR和下一代测序（NGS）分析了这些EV的DNA含量和序列富集情况。结果显示，某些单体蛋白（如E626）在多次筛选后显著富集，这表明平台能够有效识别具有特定靶向能力的分子。此外，通过超分辨率显微镜和共聚焦显微镜，研究团队进一步确认了单体蛋白在EV表面的表达情况，以及其与细胞受体的结合能力。

在体内筛选方面，研究团队采用小鼠模型，通过尾静脉注射的方式将EV引入体内，并在不同时间点（如1小时、4小时和24小时）取出目标器官（如心脏、肝脏、肺、胰腺、肾脏和脾脏）以评估EV的富集情况。结果显示，经过五轮筛选后，某些EV在胰腺中表现出显著的富集，这表明该平台能够有效筛选出针对特定器官的靶向分子。为了进一步验证这些分子的特异性，研究团队还引入了非靶向对照组（如非表面修饰的EV和负向对照单体蛋白），并发现只有在P1316展示的EV中，胰腺的富集程度显著高于其他器官，这表明该平台具有高度的靶向特异性。

此外，研究团队还开发了一种数学分析模型，用于量化EV显示库筛选过程中的选择动态。该模型揭示了单体蛋白和其编码DNA之间的复杂关系，并解释了为什么即使在单个EV之间存在较低的基因型-表型相关性，通过多次筛选仍能实现目标分子的有效富集。这一发现不仅强调了EV作为靶向递送载体的潜力，还为未来的药物筛选和递送系统提供了重要的理论依据。

VesicleVoyager平台的成功应用表明，利用EV的天然递送能力结合分子进化策略，可以实现对复杂生物系统的精准靶向。这种体内筛选方法不仅能够提高药物递送的效率，还能够减少非靶向递送带来的副作用。此外，该平台还为研究EV在生物体内如何与组织相互作用提供了新的视角，为未来的个性化医疗和精准医学提供了重要的工具。

通过这一研究，科学家们不仅展示了EV在药物递送中的潜力，还揭示了在体内筛选过程中如何克服传统方法的局限性。这种新型筛选平台的建立，为开发更高效、更安全的靶向药物递送系统奠定了基础。未来，该平台有望在多种疾病治疗中发挥重要作用，尤其是在需要高度组织特异性递送的领域。同时，该研究也为理解EV在生物体内如何与靶组织相互作用提供了新的思路，为生物医学研究开辟了新的方向。