肠球菌溶细胞素通过激活NLRP3炎症小体破坏血脑屏障加重缺血性脑卒中

《Journal of Neuroinflammation》：Enterococcus-derived cytolysin exacerbates ischemic stroke by disrupting the blood–brain barrier via NLRP3 activation

本研究针对缺血性脑卒中后肠道菌群失调如何加重神经损伤这一关键问题，揭示了肠球菌来源的溶细胞素通过激活NLRP3炎症小体介导的焦亡途径破坏血脑屏障(BBB)的新机制。研究人员通过临床队列和动物模型发现，溶细胞素阳性肠球菌富集与患者不良预后相关，在光血栓卒中(PT)模型中证实溶细胞素可破坏肠屏障和血脑屏障完整性，而NLRP3抑制剂MCC950能有效缓解神经功能缺损。该研究为靶向肠道菌?-脑轴治疗缺血性脑卒中提供了新的理论依据和治疗策略。

　　

当大脑的血液供应突然中断，缺血性脑卒中便发生了——这是全球范围内导致死亡和残疾的主要元凶之一。尽管静脉溶栓和机械取栓等再通治疗为患者带来了一线生机，但严格的时间窗、禁忌症和出血风险等因素限制了其广泛应用。面对这一沉重的健康负担，探寻脑卒中损伤的新机制已成为开发更有效神经保护策略的迫切需求。

近年来，科学家们将目光投向了人体内一个神秘的"生态系统"——肠道菌群。这个由数万亿微生物组成的复杂世界，通过所谓的"肠-脑轴"与大脑进行着密切的对话。研究表明，脑卒中患者的肠道菌群会发生显著改变，其中肠球菌(Enterococcus)的富集尤为引人注目。更值得关注的是，某些肠球菌能够产生一种名为溶细胞素(cytolysin)的毒素，这种穿孔毒素能在细胞膜上形成永久性孔隙，导致细胞内容物外泄。

那么，脑卒中后肠道中富集的肠球菌及其产生的溶细胞素，是否会穿越受损的肠道屏障进入血液循环，进而对已经脆弱的大脑造成二次打击？这正是黄佳妮、庄伟浩等研究人员在《Journal of Neuroinflammation》上发表的最新研究试图解答的核心问题。

为了深入探究这一科学问题，研究团队运用了多项关键技术方法。他们首先建立了100例缺血性脑卒中患者的前瞻性临床队列，收集发病48小时内的直肠拭子进行16S rRNA测序和cylA基因qPCR分析。在动物实验方面，研究采用C57BL/6J小鼠建立光血栓(PT)卒中模型，通过连续14天灌胃给予溶细胞素阳性肠球菌(Cyl⁺ E. f)、溶细胞素阴性肠球菌(Cyl^- E. f)或PBS进行干预。关键实验技术包括激光散斑对比成像评估脑血流、免疫荧光染色分析血脑屏障紧密连接蛋白表达、Western blot检测NLRP3炎症小体通路蛋白、体外血脑屏障通透性实验以及肠道通透性评估等。

卒中患者溶细胞素阳性肠球菌富集预示不良预后

研究团队在温州医科大学附属第一医院卒中中心招募了100例急性缺血性脑卒中患者，发现在360天随访期内，死亡患者肠道中肠球菌属的相对丰度和溶细胞素外毒素基因cylA的表达量均显著高于存活患者。ROC分析显示cylA水平对死亡率具有较好的预测价值(AUC=0.688)，而结合年龄和NIHSS评分的综合模型预测效能更佳(AUC=0.787)。多因素Cox回归分析证实cylA是360天死亡的独立危险因素，表明肠道溶细胞素阳性肠球菌可作为脑卒中患者预后的潜在生物标志物。

溶细胞素加重缺血性脑损伤

在动物实验中，研究人员发现PT模型小鼠的粪便菌群组成发生显著改变，肠球菌明显富集。通过给小鼠灌胃Cyl⁺ E. f、Cyl^- E. f或PBS，他们发现与PT+PBS和PT+Cyl^- E. f组相比，PT+Cyl⁺ E. f组小鼠的神经功能缺损更严重，梗死区脑血流量减少更显著，凋亡细胞数量更多。这些结果说明溶细胞素能够加重缺血性脑损伤。

溶细胞素破坏血脑屏障完整性

血脑屏障是维持中枢神经系统稳态的重要结构，其破坏与脑卒中预后密切相关。研究显示，PT+Cyl⁺ E. f组小鼠的脑水肿程度、白蛋白外渗和伊文思蓝通透性均显著增加，紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-5的表达明显减少且分布不连续。体外实验进一步证实，Cyl⁺ E. f上清液处理可增加bEnd.3细胞的FITC-葡聚糖通透性，并促进炎症因子CXCL1、CCL2、CCL5和CXCL10的释放，表明溶细胞素能直接损伤脑血管内皮细胞功能。

NLRP3炎症小体激活介导溶细胞素的致病作用

为了阐明溶细胞素破坏血脑屏障的机制，研究人员对小鼠脑组织进行RNA测序分析。结果显示，PT+Cyl⁺ E. f组中与"NOD样受体信号通路"相关的基因显著富集。Western blot和qPCR分析证实，Cyl⁺ E. f处理可上调脑组织和bEnd.3细胞中NLRP3、GSDMD、IL-1β和IL-18的表达，激活典型的炎症小体焦亡通路。值得注意的是，使用特异性NLRP3抑制剂MCC950处理，可显著改善溶细胞素引起的神经功能缺损、减少细胞凋亡、降低血脑屏障通透性，并抑制炎症因子释放。

溶细胞素损伤肠道屏障功能

研究人员推测溶细胞素对血脑屏障的破坏作用可能始于其对肠道屏障的损伤。实验结果显示，Cyl⁺ E. f灌胃小鼠血清D-乳酸水平和FITC-葡聚糖通透性显著升高，肠道紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达减少且连续性中断，表明溶细胞素可破坏肠道上皮屏障功能，这可能为细菌毒素进入循环系统并到达大脑创造了条件。

NLRP3抑制逆转溶细胞素诱导的脑损伤

为了验证NLRP3在溶细胞素致病过程中的关键作用，研究团队使用MCC950进行干预治疗。结果显示，MCC950处理可显著改善PT+Cyl⁺ E. f小鼠的神经功能评分，减少梗死区细胞凋亡，降低血脑屏障通透性，并部分恢复紧密连接蛋白表达。体外实验同样表明，MCC950能缓解溶细胞素引起的内皮屏障功能损伤和炎症反应，证实抑制NLRP3活化可对抗溶细胞素的神经毒性作用。

本研究通过临床队列与实验研究相结合的策略，系统阐述了肠球菌溶细胞素在缺血性脑卒中病理进程中的关键作用及分子机制。研究发现不仅揭示了肠道菌群衍生毒素通过肠-脑轴参与脑损伤的新途径，更重要的是明确了NLRP3炎症小体激活在这一过程中的核心地位。溶细胞素作为穿孔毒素，可能通过诱导钾离子外流激活NLRP3炎症小体，进而触发caspase-1依赖的焦亡通路，导致血脑屏障功能障碍。

研究的创新性在于首次将肠球菌溶细胞素与缺血性脑卒中的神经血管损伤直接联系起来，并阐明了NLRP3信号通路在这一过程中的桥梁作用。此外，研究采用的光血栓卒中模型产生的小梗死灶更符合临床常见的中小卒中特点，提高了研究结果的临床转化价值。值得注意的是，NLRP3抑制剂MCC950展现出的神经保护效果为靶向肠道菌群-脑轴治疗缺血性脑卒中提供了新的思路。

然而，研究也存在一定局限性。目前结论尚未在大规模临床队列中得到验证，溶细胞素的纯化技术难题限制了其直接生物学效应研究，且溶细胞素影响NLRP3的具体分子机制仍有待深入探索。未来研究可聚焦于优化溶细胞素的合成纯化工艺，开发特异性中和抗体，并利用蛋白质组学和表观遗传学分析揭示其与NLRP3互作的精细调控网络。

总之，这项研究开创性地证实了肠球菌溶细胞素作为连接肠道菌群失调与脑损伤的关键分子，通过激活NLRP3炎症小体破坏血脑屏障，加重缺血性脑卒中病理进程。这一发现不仅深化了对肠-脑轴相互作用机制的理解，也为开发针对肠道菌群及其代谢产物的精准脑卒中治疗策略提供了重要理论依据和实验基础。