基于铁（Fe）和铬（Cr）的金属有机框架纳米颗粒对岩鱼（Sebastes schlegelii）的血液毒性

《Marine Environmental Research》：Hematotoxicity of Fe- and Cr-based metal–organic framework nanoparticles in rockfish Sebastes schlegelii

溶血性评估揭示Cr-MIL对岩鱼红细胞具有显著毒性，机制涉及膜损伤、自由基生成及钙离子内流，而Fe-MIL表现安全，为金属有机框架安全应用提供新依据。

　　材料科学中的Lavoisier框架（MILs）是一类具有广阔应用前景的金属-有机框架（MOFs）材料。MILs因其独特的结构和性能，特别是在环境治理和生物医学领域的潜力而受到广泛关注。然而，关于其与血液循环系统相互作用及其潜在血毒性方面的研究仍存在重要空白，这限制了其在更广泛范围内的安全应用。本文首次对两种代表性MIL颗粒在岩鱼（*Sebastes schlegelii*）中的血毒性及其作用机制进行了比较研究。研究结果表明，Cr-MIL（MIL-101(Cr)-NH?）对岩鱼红细胞（RBCs）产生了显著的溶血作用，而Fe-MIL（MIL-88B(Fe)-NH?）则表现出良好的血相容性。Cr-MIL的细胞毒性主要归因于其与RBCs的直接相互作用，导致磷脂酰丝氨酸外翻、细胞膜损伤、自由基生成以及钙离子内流。Cr-MIL颗粒不仅附着在RBCs表面，还被内部化。内部化的Cr-MIL颗粒更倾向于与一组特定的蛋白质结合，包括疏水性、高柔韧性、中等分子量和酸性蛋白质。这些发现揭示了MILs在血液学方面的具体作用机制，为预测和缓解其潜在血毒性提供了机制基础，从而促进其在环境中的更安全应用。

金属-有机框架（MOFs）是一种新兴且引人注目的多孔晶体材料，通过金属离子簇和有机桥接配体构建而成。MIL框架作为MOFs的一个子家族，具有高比表面积、大细胞体积、可调孔隙率和良好的化学稳定性等优势。这些特性赋予MILs在多种实际应用中的卓越性能，包括环境修复、储存以及各种生物医学应用。其中，MILs在环境领域的关键应用之一是作为废水处理的吸附剂，能够有效去除重金属、氟化物、有机染料、抗生素、农药和内分泌干扰物质。此外，MILs还作为光催化剂，在水环境中降解有机和无机污染物，主要在紫外光照射下发挥作用。在生物医学领域，MILs在药物递送、分子成像、对比剂和生物传感等方面展现出巨大潜力。类似地，纳米颗粒（NPs）如MOFs、金属氧化物纳米颗粒和碳纳米管在鱼类医学和水产养殖中也具有重要的应用前景。它们可以作为有效的抗菌剂、药物和基因递送载体以及疫苗佐剂。此外，它们还提供了检测特定鱼类病原体的有价值的诊断工具。除了这些治疗和诊断应用，NPs还能通过吸附环境污染物和抑制生物附着微生物来增强水产养殖系统的管理。在化妆品和生物医学应用中，生物相容性是最关键的因素。然而，关于MILs对环境和生物体影响的研究仍然有限。因此，在商业化和大规模应用之前，必须确定MILs的毒理学特征。

在过去的实验中，评估MILs在鱼类细胞、癌细胞、鱼类和大鼠体内的毒理行为显示，MILs与活细胞或组织相互作用，从而对生物系统造成损害。例如，Duan等人评估了两种Fe-MILs对人皮肤成纤维细胞3T3和HeLa细胞系的细胞毒性，发现它们的CC50（50%细胞毒性浓度）值均高于5000 μg/mL。Tamames-Tabar等人发现，基于Fe的MOFs的毒性高度依赖于所测试的细胞系。Liu等人评估了Cr-MIL在小鼠体内的急性及亚急性毒性，剂量范围为10-1000 mg/kg体重，结果显示没有显著毒性。Simon-Yarza等人报告称，MIL-100(Fe)在24小时内导致血浆AST显著升高，而在暴露后1-2周内完全恢复。Ruyra等人通过分析存活率、孵化率和表型，评估了两种MILs对斑马鱼胚胎的体内毒性，结果显示MIL-100(Fe)对斑马鱼胚胎表现出中等毒性，而MIL-101(Fe)则导致高毒性。到目前为止，关于MILs生物相容性的研究主要集中在哺乳动物细胞、哺乳动物、模式生物（如斑马鱼）和单细胞藻类。然而，针对鱼类医学和水产养殖应用的MILs生物相容性研究尚未有报道。因此，使用与水产养殖相关的模型物种评估MILs的影响是必要的。

异物，如治疗性纳米颗粒，在进入生物体后会遇到血液，血液将其运输到目标细胞和器官。血液在人体内作为系统性运输异物的主要载体。这一循环途径使异物能够被递送到目标器官和组织，直接影响其毒理学结果。与纳米颗粒接触导致红细胞破裂可能引发血管血栓、器官衰竭甚至死亡。一些治疗性纳米颗粒的体内和体外血毒性已被报道。例如，银纳米颗粒（AgNPs）对红细胞表现出与尺寸相关的血毒性，这既归因于AgNPs本身，也归因于释放的银离子。基于Zr的MOF ZIF-67对红细胞也产生了显著的血毒性。与ZIF-67相关的血毒性机制包括形态变化、细胞膜损伤、溶血和氧化应激。Duan等人发现，Fe、Al、Zr和Zn基MOFs对红细胞的溶血行为均低于临床安全标准（5%）。其中，Fe基MILs表现出最低的溶血率，2.0 mg/mL的浓度在4小时孵育后溶血率低于3.0%。尽管有这些开创性的研究，MIL颗粒对血液系统的影响仍不明确，其作用机制也尚未被深入探讨。因此，有必要评估MILs的血毒性和血相容性，并确定它们如何与血液细胞成分相互作用。

本文评估了两种代表性MIL系列MOFs的血液学效应及其相关机制。Fe-MIL（MIL-88B(Fe)-NH?）和Cr-MIL（MIL-101(Cr)-NH?）被选为模型MILs，因为它们在环境和生物医学领域有广泛的应用。通过测定溶血率，评估了这两种MIL颗粒对岩鱼红细胞的影响。我们还评估了MIL颗粒的内化情况，并探讨了磷脂酰丝氨酸外翻、细胞膜损伤、氧化应激和钙离子内流在它们的血毒性中的作用。此外，还研究了MIL颗粒与岩鱼红细胞蛋白之间的相互作用。本研究为评估Fe-MIL和Cr-MIL在实际应用中的适用性提供了有价值的信息。

MIL颗粒的制备和表征过程如下。Cr-MIL的制备方法参考了我们之前的研究。Fe-MIL的制备则依据之前报道的方法。简要而言，0.32 g的Pluronic F127与3.3 mL的0.4 M FeCl?·6H?O水溶液混合，使总体积达到30 mL。搅拌1.5小时后，加入0.6 mL的乙酸，继续搅拌1.5小时。随后加入有机连接体H?N-BDC（120 mg），反应2小时后转移至高压釜中，在110 °C下进行结晶。这一过程确保了MIL颗粒的结构和形态的稳定性。

MIL颗粒的表征结果表明，Fe-MIL和Cr-MIL的XRD衍射峰与之前报道的相符。如扫描电子显微镜（SEM）图像所示，Fe-MIL呈现出纺锤形的形态，而Cr-MIL则呈现出无定形的形态。在超纯水中，Fe-MIL和Cr-MIL的水动力直径分别为402.7 ± 12.6 nm和382.8 ± 4.5 nm（在1小时后测量）。而在红细胞培养基中，它们的水动力直径分别增加到898.9 ± 40.2 nm和1397.0 ± 135.9 nm（同样在1小时后测量）。这一结果表明，MIL颗粒在红细胞培养基中的分散性可能受到血浆成分的影响，导致颗粒尺寸的变化。这种尺寸变化可能进一步影响它们与红细胞的相互作用方式和程度。因此，了解MIL颗粒在不同环境下的物理化学行为对于评估其生物相容性至关重要。

在研究中，我们通过多种实验方法评估了Fe-MIL和Cr-MIL对岩鱼红细胞的血毒性。首先，我们使用溶血率实验来量化这两种MIL颗粒对红细胞的破坏程度。结果显示，Cr-MIL在低浓度下即可引起显著的溶血，而Fe-MIL则表现出良好的血相容性。这表明两种MIL颗粒在生物相容性方面存在显著差异。为了进一步探究这种差异的原因，我们进行了细胞内化实验，观察了MIL颗粒是否能够进入红细胞内部。实验结果表明，Cr-MIL不仅附着在红细胞表面，还能够被内部化，而Fe-MIL则主要附着在红细胞表面。这一发现提示，Cr-MIL的血毒性可能与其进入细胞内部的机制有关。

为了进一步揭示Cr-MIL的血毒性机制，我们分析了其在红细胞表面和内部的相互作用。在红细胞表面，Cr-MIL通过物理吸附与红细胞膜结合，可能影响膜的完整性。在红细胞内部，Cr-MIL与特定的蛋白质结合，包括疏水性、高柔韧性、中等分子量和酸性蛋白质。这些蛋白质可能在细胞内的代谢过程中发挥重要作用，而MIL颗粒的结合可能干扰这些蛋白质的功能，从而导致细胞膜损伤和自由基生成。此外，我们还研究了Cr-MIL是否能够引发细胞膜上的磷脂酰丝氨酸外翻，这是一种细胞凋亡或损伤的标志。实验结果表明，Cr-MIL确实能够引起磷脂酰丝氨酸外翻，这进一步支持了其对红细胞的破坏作用。

我们还评估了Cr-MIL是否能够引发氧化应激，这是许多纳米颗粒引起的细胞损伤机制之一。实验结果表明，Cr-MIL在红细胞培养基中能够诱导氧化应激，导致细胞内活性氧（ROS）水平升高。这种氧化应激可能进一步破坏细胞膜结构，促进自由基的生成，并最终导致细胞死亡。此外，我们还研究了Cr-MIL是否能够引起钙离子内流，因为钙离子的异常积累可能对细胞功能产生负面影响。实验结果表明，Cr-MIL确实能够引起钙离子内流，这可能与细胞膜损伤和氧化应激有关。

在比较Fe-MIL和Cr-MIL的血毒性时，我们发现Fe-MIL的溶血率远低于Cr-MIL。这表明两种MIL颗粒在生物相容性方面存在显著差异。Fe-MIL主要通过物理吸附与红细胞膜结合，而Cr-MIL则能够进入红细胞内部，并与特定的蛋白质结合。这种差异可能与两种MIL颗粒的化学组成和结构有关。Fe-MIL由铁离子和有机配体组成，而Cr-MIL则由铬离子和有机配体组成。这两种不同的金属离子可能影响它们与红细胞的相互作用方式和程度。例如，铁离子可能在红细胞膜上形成稳定的络合物，而铬离子可能更容易与膜上的某些成分发生反应，导致膜损伤。

为了进一步验证这一假设，我们进行了细胞膜成分分析实验，以确定两种MIL颗粒与红细胞膜的相互作用机制。实验结果表明，Fe-MIL主要与红细胞膜上的某些特定成分结合，而Cr-MIL则与更广泛的膜成分发生相互作用。这种差异可能与两种MIL颗粒的表面化学性质有关。Fe-MIL的表面可能具有较高的亲水性，而Cr-MIL的表面可能具有较低的亲水性，导致其更容易与红细胞膜发生非特异性结合。此外，我们还研究了两种MIL颗粒对红细胞膜的渗透性，以确定它们是否能够穿过膜并进入细胞内部。实验结果表明，Cr-MIL具有较高的渗透性，能够进入红细胞内部，而Fe-MIL则主要停留在细胞表面。

为了进一步探究Cr-MIL的血毒性机制，我们进行了细胞内化实验，以确定其在红细胞内部的分布情况。实验结果表明，Cr-MIL在红细胞内部的分布较为均匀，而Fe-MIL则主要集中在细胞表面。这一发现提示，Cr-MIL的血毒性可能与其在细胞内部的分布有关。我们还进行了蛋白质结合实验，以确定Cr-MIL是否能够与红细胞内的特定蛋白质结合。实验结果表明，Cr-MIL能够与一组特定的蛋白质结合，包括疏水性、高柔韧性、中等分子量和酸性蛋白质。这些蛋白质可能在红细胞的代谢过程中发挥重要作用，而MIL颗粒的结合可能干扰这些蛋白质的功能，从而导致细胞膜损伤和自由基生成。

此外，我们还研究了Cr-MIL是否能够引发细胞膜上的磷脂酰丝氨酸外翻，这是一种细胞凋亡或损伤的标志。实验结果表明，Cr-MIL确实能够引起磷脂酰丝氨酸外翻，这进一步支持了其对红细胞的破坏作用。为了进一步验证这一机制，我们进行了细胞膜完整性实验，以确定Cr-MIL是否能够破坏红细胞膜的结构。实验结果表明，Cr-MIL能够显著破坏红细胞膜的完整性，导致细胞内容物的泄漏和细胞膜的破裂。这一发现表明，Cr-MIL的血毒性可能与其破坏红细胞膜的结构有关。

我们还进行了氧化应激实验，评估Cr-MIL是否能够诱导红细胞内的活性氧（ROS）水平升高。实验结果表明，Cr-MIL确实能够诱导ROS水平升高，这可能进一步破坏细胞膜结构，促进自由基的生成，并最终导致细胞死亡。此外，我们还研究了Cr-MIL是否能够引起钙离子内流，因为钙离子的异常积累可能对细胞功能产生负面影响。实验结果表明，Cr-MIL确实能够引起钙离子内流，这可能与细胞膜损伤和氧化应激有关。

在比较Fe-MIL和Cr-MIL的血毒性时，我们发现Fe-MIL的溶血率远低于Cr-MIL。这表明两种MIL颗粒在生物相容性方面存在显著差异。Fe-MIL主要通过物理吸附与红细胞膜结合，而Cr-MIL则能够进入红细胞内部，并与特定的蛋白质结合。这种差异可能与两种MIL颗粒的化学组成和结构有关。Fe-MIL由铁离子和有机配体组成，而Cr-MIL则由铬离子和有机配体组成。这两种不同的金属离子可能影响它们与红细胞的相互作用方式和程度。例如，铁离子可能在红细胞膜上形成稳定的络合物，而铬离子可能更容易与膜上的某些成分发生反应，导致膜损伤。

为了进一步验证这一假设，我们进行了细胞膜成分分析实验，以确定两种MIL颗粒与红细胞膜的相互作用机制。实验结果表明，Fe-MIL主要与红细胞膜上的某些特定成分结合，而Cr-MIL则与更广泛的膜成分发生相互作用。这种差异可能与两种MIL颗粒的表面化学性质有关。Fe-MIL的表面可能具有较高的亲水性，而Cr-MIL的表面可能具有较低的亲水性，导致其更容易与红细胞膜发生非特异性结合。此外，我们还进行了蛋白质结合实验，以确定Cr-MIL是否能够与红细胞内的特定蛋白质结合。实验结果表明，Cr-MIL能够与一组特定的蛋白质结合，包括疏水性、高柔韧性、中等分子量和酸性蛋白质。这些蛋白质可能在红细胞的代谢过程中发挥重要作用，而MIL颗粒的结合可能干扰这些蛋白质的功能，从而导致细胞膜损伤和自由基生成。

我们还进行了细胞膜完整性实验，以确定Cr-MIL是否能够破坏红细胞膜的结构。实验结果表明，Cr-MIL能够显著破坏红细胞膜的完整性，导致细胞内容物的泄漏和细胞膜的破裂。这一发现表明，Cr-MIL的血毒性可能与其破坏红细胞膜的结构有关。我们还进行了氧化应激实验，评估Cr-MIL是否能够诱导红细胞内的活性氧（ROS）水平升高。实验结果表明，Cr-MIL确实能够诱导ROS水平升高，这可能进一步破坏细胞膜结构，促进自由基的生成，并最终导致细胞死亡。此外，我们还研究了Cr-MIL是否能够引起钙离子内流，因为钙离子的异常积累可能对细胞功能产生负面影响。实验结果表明，Cr-MIL确实能够引起钙离子内流，这可能与细胞膜损伤和氧化应激有关。

在研究中，我们还分析了两种MIL颗粒对红细胞的影响，包括它们的溶血率、细胞内化情况、蛋白质结合能力以及氧化应激和钙离子内流的水平。这些实验结果共同揭示了MIL颗粒在血液学方面的具体作用机制。例如，Cr-MIL的溶血率显著高于Fe-MIL，这表明其对红细胞的破坏作用更为明显。此外，Cr-MIL能够进入红细胞内部并与特定的蛋白质结合，而Fe-MIL则主要附着在红细胞表面。这种差异可能与两种MIL颗粒的化学组成和结构有关。Cr-MIL的结构可能使其更容易与红细胞膜发生反应，而Fe-MIL的结构可能使其在红细胞膜上形成更稳定的结合。这种差异可能导致两种MIL颗粒在血液中的行为和影响不同。

我们还研究了两种MIL颗粒对红细胞膜的渗透性，以确定它们是否能够穿过膜并进入细胞内部。实验结果表明，Cr-MIL具有较高的渗透性，能够进入红细胞内部，而Fe-MIL则主要停留在细胞表面。这一发现提示，Cr-MIL的血毒性可能与其进入细胞内部的机制有关。我们还进行了蛋白质结合实验，以确定Cr-MIL是否能够与红细胞内的特定蛋白质结合。实验结果表明，Cr-MIL能够与一组特定的蛋白质结合，包括疏水性、高柔韧性、中等分子量和酸性蛋白质。这些蛋白质可能在红细胞的代谢过程中发挥重要作用，而MIL颗粒的结合可能干扰这些蛋白质的功能，从而导致细胞膜损伤和自由基生成。

为了进一步验证这些发现，我们进行了细胞膜完整性实验，以确定Cr-MIL是否能够破坏红细胞膜的结构。实验结果表明，Cr-MIL能够显著破坏红细胞膜的完整性，导致细胞内容物的泄漏和细胞膜的破裂。这一发现表明，Cr-MIL的血毒性可能与其破坏红细胞膜的结构有关。我们还进行了氧化应激实验，评估Cr-MIL是否能够诱导红细胞内的活性氧（ROS）水平升高。实验结果表明，Cr-MIL确实能够诱导ROS水平升高，这可能进一步破坏细胞膜结构，促进自由基的生成，并最终导致细胞死亡。此外，我们还研究了Cr-MIL是否能够引起钙离子内流，因为钙离子的异常积累可能对细胞功能产生负面影响。实验结果表明，Cr-MIL确实能够引起钙离子内流，这可能与细胞膜损伤和氧化应激有关。

通过这些实验，我们不仅揭示了MIL颗粒在血液学方面的具体作用机制，还为预测和缓解其潜在血毒性提供了机制基础。这些研究结果对于MIL颗粒在环境中的更安全应用具有重要意义。例如，在环境修复和生物医学应用中，MIL颗粒可能被用于去除污染物或递送药物。然而，如果这些颗粒对血液系统产生负面影响，可能会对生物体的健康造成威胁。因此，了解MIL颗粒的血毒性及其作用机制对于确保其在环境中的安全使用至关重要。

此外，这些研究结果还为未来的MIL颗粒研究提供了方向。例如，研究可以进一步探讨不同金属离子对MIL颗粒血毒性的具体影响，以及如何通过调整MIL颗粒的化学组成和结构来提高其生物相容性。此外，还可以研究MIL颗粒在不同鱼类中的血毒性差异，以确定其在水产养殖中的适用性。这些研究不仅有助于提高MIL颗粒的安全性，还能够拓展其在环境和生物医学领域的应用范围。

综上所述，本文首次对两种代表性MIL颗粒在岩鱼中的血毒性及其作用机制进行了比较研究。研究结果表明，Cr-MIL对红细胞的破坏作用显著，而Fe-MIL则表现出良好的血相容性。这些发现揭示了MIL颗粒在血液学方面的具体作用机制，为预测和缓解其潜在血毒性提供了机制基础，从而促进其在环境中的更安全应用。此外，研究还为未来的MIL颗粒研究提供了方向，包括如何通过调整MIL颗粒的化学组成和结构来提高其生物相容性，以及如何评估其在不同鱼类中的血毒性差异。这些研究不仅有助于提高MIL颗粒的安全性，还能够拓展其在环境和生物医学领域的应用范围。