蛋氨酸缺乏通过氧化应激与DNA损伤通路诱发精原细胞凋亡的机制研究

《Biological Research》：Methionine deficiency causes spermatogonial apoptosis via oxidative stress and DNA damage response pathway

本研究针对蛋氨酸缺乏如何影响早期精子发生的关键问题，通过构建蛋氨酸缺乏小鼠模型和GC-1细胞实验，发现蛋氨酸缺乏会通过激活整合应激反应（ISR），诱导线粒体功能障碍和ROS积累，进而激活CHK2-p53/p21信号通路导致精原细胞DNA损伤和凋亡。该研究为理解蛋氨酸在雄性生殖健康中的作用提供了重要机制依据，对优化膳食干预策略具有指导意义。

　　

在男性生殖健康领域，精子发生障碍是导致不育的重要原因之一。近年来，膳食营养对生殖功能的影响备受关注，其中蛋氨酸作为必需氨基酸，在蛋白质合成和氧化平衡中扮演关键角色。虽然已有研究表明蛋氨酸限制或缺乏会对精液质量产生不利影响，但其对早期精子发生过程的具体作用机制尚不明确。特别是在青春期前的睾丸发育关键期，蛋氨酸缺乏是否会影响精原细胞的增殖与存活，以及其中的分子通路如何调控，都是亟待解答的科学问题。

为了深入探究这一问题，Wang等人发表在《Biological Research》的研究通过构建蛋氨酸膳食模型（0.86%、0.17%、0%），系统分析了蛋氨酸缺乏对小鼠睾丸发育和精子发生的影响。研究发现，蛋氨酸完全缺乏会显著抑制精原细胞增殖并促进其凋亡，而蛋氨酸限制则未引起明显异常。进一步机制研究表明，蛋氨酸缺乏会激活整合应激反应（ISR），引起线粒体膜电位去极化、活性氧（ROS）积累，并上调DNA损伤应答相关蛋白（如γH2AX、p-CHK2和p-p53），最终通过CHK2-p53/p21信号级联反应诱发精原细胞凋亡。该研究不仅揭示了蛋氨酸在维持雄性生殖健康中的关键作用，也为相关生殖障碍的防治提供了新的理论依据。

研究人员主要采用以下关键技术方法开展研究：（1）通过定制不同蛋氨酸含量的饲料建立小鼠膳食干预模型；（2）利用组织切片H&E染色、免疫荧光染色和Western blot分析睾丸组织形态与蛋白表达；（3）采用TUNEL染色和免疫荧光标记检测细胞凋亡与DNA损伤；（4）通过RNA测序和RT-qPCR分析GC-1细胞转录组变化；（5）使用JC-1、DCFH-DA等荧光探针检测线粒体功能与氧化应激水平；（6）应用CCK-8和EdU掺入实验评估细胞活力与增殖能力。

Methionine deprivation but not methionine restriction blocks spermatogenesis in mice

通过建立蛋氨酸膳食干预模型，研究发现蛋氨酸完全缺乏（Met-）会导致小鼠体重、睾丸重量显著降低，曲细精管直径减小，生精过程严重受损。而蛋氨酸限制（MR）组则未出现明显异常。附睾头部HE和PNA染色显示Met-组几乎无精子存在，表明蛋氨酸缺乏会破坏精子发生。

Methionine deprivation downregulates the expression of partial steroidogenic enzymes

免疫荧光和Western blot结果显示，蛋氨酸缺乏显著降低了睾丸中StAR和3β-HSD等类固醇合成关键酶的表达，而17β-HSD和CYP17A1未见明显变化，提示蛋氨酸缺乏可能影响Leydig细胞的类固醇合成功能。

Methionine deprivation does not affect the function of Sertoli cells

通过检测Sertoli细胞标志物SOX9及血睾屏障（BTB）相关蛋白（ZO-1、Claudin 11等），发现蛋氨酸缺乏并未影响Sertoli细胞数量和BTB完整性，表明蛋氨酸缺乏对睾丸的损害主要针对生殖细胞而非支持细胞。

Methionine deprivation caused a decrease in the number of mouse germ cells

免疫荧光染色显示，蛋氨酸缺乏导致精原细胞（c-KIT⁺）数量显著减少，减数分裂标志物SYCP3及生殖细胞标志物TRA98、DDX4阳性细胞数也明显降低。同时，Ki-67阳性细胞减少，而γH2AX、TUNEL和c-PARP1阳性细胞增加，表明蛋氨酸缺乏抑制精原细胞增殖并促进其DNA损伤与凋亡。

Methionine deprivation disturbs transcriptome homeostasis in GC-1 cells

RNA测序分析发现，蛋氨酸缺乏导致GC-1细胞中3732个转录本差异表达，其中线粒体功能相关基因（Gpx4、Fis1等）下调，而ISR（Atf4、Chac1等）和DNA损伤应答基因（Cdkn1a、Chek2等）上调。KEGG和GO分析提示蛋氨酸缺乏引发线粒体功能障碍和DNA损伤应答。

Methionine deprivation causes GC-1 apoptosis via the DNA

JC-1染色显示蛋氨酸缺乏引起线粒体膜电位去极化，DCFH-DA和MitoSOX检测表明ROS和线粒体超氧化物积累。免疫荧光和Western blot结果显示γH2AX焦点形成增加，p-CHK2、p-p53、p21等DNA损伤应答蛋白及凋亡相关蛋白（PUMA、BAX、c-PARP1）上调，BCL2下调，证实蛋氨酸缺乏通过氧化应激和DNA损伤通路诱导GC-1细胞凋亡。

NAC partially rescues mitochondrial function and GC-1 cell proliferation

抗氧化剂NAC处理可显著降低Met- GC-1细胞中ROS和MitoSOX水平，并部分恢复细胞活力和增殖能力，表明氧化应激在蛋氨酸缺乏诱导的精原细胞凋亡中起关键作用。

本研究系统阐明了蛋氨酸缺乏通过激活ISR-氧化应激-CHK2-p53/p21信号轴诱导线粒体功能障碍和DNA损伤，最终导致精原细胞凋亡的分子机制。该研究不仅深化了对蛋氨酸在雄性生殖中作用的理解，也为膳食蛋氨酸平衡对维持生殖健康的重要性提供了实验依据，对预防和治疗相关生殖障碍具有重要参考价值。