天然细胞膜中膜转运蛋白的动态结构

《SCIENCE ADVANCES》：Dynamic structures of a membrane transporter in native cellular membranes

固态核磁共振（ssNMR）揭示Bradyrhizobium japonicum SemiSWEET在天然细胞膜中存在外开放（1.5?）和闭合（2.5?）两种功能构象，其交换速率与蔗糖转运速率一致，且受膜脂环境影响显著。

　　膜转运蛋白是细胞膜中不可或缺的结构，它们在维持细胞内稳态、调节信号通路以及运输关键营养物质、废物和信号分子方面发挥着重要作用。转运过程通常涉及转运蛋白在不同功能构象之间的转换，这些构象变化对于理解其分子机制至关重要。然而，由于转运蛋白在细胞膜中的复杂环境，传统结构生物学技术难以准确捕捉这些动态变化。因此，探索在原生细胞膜环境中转运蛋白的构象及其转换机制成为当前研究的热点。

近年来，随着单颗粒冷冻电镜和X射线晶体学等结构生物学技术的发展，研究人员在去垢剂环境中获得了多种转运蛋白的高分辨率三维结构，揭示了其在不同功能状态下的构象差异。然而，这些结构往往受到非天然条件的影响，例如膜组成、疏水性和曲率等，可能导致转运蛋白在功能状态下的结构改变。此外，为了稳定功能状态，常使用抗原结合片段（Fabs）、纳米抗体（Nbs）、融合标签等方法，但这些方法可能干扰转运蛋白的天然结构，从而影响对其功能机制的正确解读。因此，有必要探索一种能够在原生细胞膜中研究转运蛋白动态结构的新方法。

在这一背景下，原位固态核磁共振（ssNMR）技术展现出独特的优势。ssNMR能够在不干扰转运蛋白天然状态的情况下，对膜蛋白的结构和动态变化进行高分辨率分析。本研究中，我们采用原位ssNMR技术，成功解析了Bradyrhizobium japonicum的SemiSWEET蛋白（BjSemiSWEET）在细胞膜中的两种功能构象——外向开放（outward-open）和闭合（occluded）结构，分辨率达到了1.5 ?和2.5 ?。这些结果不仅提供了对转运蛋白动态结构的全新见解，也为理解其在细胞膜中的功能机制提供了重要的基础。

我们发现，BjSemiSWEET在细胞膜中的这两种构象之间可以发生快速的转换，时间尺度在毫秒到秒之间，且转换速率与蔗糖运输速率相一致。通过分子动力学（MD）模拟进一步验证了这些构象代表了蔗糖运输过程中的功能状态。相比之下，在合成磷脂双分子层（如DMPC/DMPG或POPC/POPG）中，BjSemiSWEET表现出不同的构象动态。这表明，原位ssNMR能够揭示在合成膜环境中无法观察到的天然构象变化，为研究膜蛋白的动态行为提供了新的视角。

本研究中，我们采用了一系列优化的实验策略，以提高膜蛋白在原生细胞膜中的检测灵敏度并减少背景信号的干扰。这些策略包括选择合适的细菌株系进行表达、使用双培养基（natural abundance LB和¹³C、¹⁵N标记的M9）以增强目标蛋白的密度，以及通过蔗糖密度梯度离心法分离细胞膜成分。这些方法确保了我们能够获得高质量的ssNMR光谱，从而实现对¹³C和¹⁵N标记的¹³C-¹³C和¹³C-¹⁵N的化学交换相关信号的准确解析。

为了进一步确认这两种构象的动态特性，我们还进行了温度依赖性的ssNMR实验。结果表明，随着温度的变化，BjSemiSWEET的构象转换速率发生显著变化，且这些变化与已知的蔗糖运输速率相吻合。通过2D CEST-NCA和2D CSA-CODEX-NCA实验，我们直接观测到了构象交换的证据，并计算出其交换速率约为56.2 s^?1。这些发现表明，BjSemiSWEET在细胞膜中的构象转换是其功能活动的一部分，而这一过程在合成膜中并未被观察到。

此外，我们还通过MD模拟分析了¹³C-¹³C距离约束和氢键约束对构象转换的影响。结果表明，在外向开放构象中，TM1螺旋主要通过与同源单体中的Loop L2-3残基之间的相互作用保持稳定，而在闭合构象中，TM1螺旋则主要依赖于与磷脂头部基团的静电相互作用。这些相互作用的变化进一步解释了< i>BjSemiSWEET在不同构象间的转换机制。同时，我们还发现，Loop L2-3在两种构象中的位置存在显著差异，这一现象可能与膜环境的复杂性和多样性密切相关。

在原生细胞膜中，BjSemiSWEET的两种构象分别对应于外向开放和闭合状态，且它们在细胞膜中的分布比例为70%和30%。相比之下，在合成DMPC/DMPG双分子层中，BjSemiSWEET主要以闭合构象存在，其比例为95%，而外向开放构象的比例仅为5%。这一差异可能源于合成膜中膜成分的不完全模拟，例如脂质组成、厚度和曲率等因素的改变，导致< i>BjSemiSWEET的构象分布发生偏移。

我们还利用MD模拟研究了蔗糖通过< i>BjSemiSWEET的运输过程，将整个运输过程划分为两个子过程：蔗糖进入和释放。通过定义两个反应坐标，我们能够更精确地描述蔗糖在膜蛋白通道中的位置变化和构象转换。模拟结果表明，BjSemiSWEET在运输过程中经历了从外向开放到闭合再到释放的动态变化，其中闭合构象可能对应于蔗糖进入细胞膜内部的阶段，而外向开放构象则可能对应于蔗糖被释放到细胞外的阶段。这些模拟结果与ssNMR实验结果一致，进一步支持了我们对< i>BjSemiSWEET在运输过程中的功能构象的假设。

值得注意的是，BjSemiSWEET的两种构象在细胞膜中的能量差异较小（约5 kJ/mol），这表明它们在细胞膜中的动态交换是高度可能的。而在合成膜中，能量差异较大（约10 kJ/mol），导致主要以闭合构象存在。这一发现强调了膜环境在调控转运蛋白构象和功能中的关键作用。此外，我们还通过氢氘交换实验验证了两种构象在细胞膜中的开放性和闭合性，结果表明，外向开放构象的孔道内表面更为开放，导致更高的氢氘交换水平，而闭合构象的孔道则相对封闭。

为了进一步揭示< i>BjSemiSWEET的结构特征，我们还利用Xplor-NIH软件对两种构象的三维结构进行了计算分析。通过结合化学交换相关信号和距离约束，我们获得了两种构象的高质量结构模型，并计算了其回旋半径（RMSD）值。这些结构模型不仅揭示了< i>BjSemiSWEET在两种构象中的空间分布，还提供了对其功能动态的深入理解。

此外，我们还通过比较不同膜环境下的< i>BjSemiSWEET的构象分布，发现其在原生细胞膜中的动态行为与其在合成膜中的行为存在显著差异。这一现象可能与细胞膜的复杂性有关，包括其脂质成分的多样性、膜厚度的差异以及膜曲率的影响。因此，研究膜蛋白的动态结构必须考虑其所在的膜环境，而合成膜可能无法完全模拟天然细胞膜的复杂特性。

本研究的成果不仅为理解< i>BjSemiSWEET的运输机制提供了重要的结构和动态信息，也为原位ssNMR技术在研究膜蛋白功能动态中的应用提供了有力支持。通过结合多种实验方法，如ssNMR、MD模拟和氢氘交换实验，我们能够更全面地揭示膜蛋白在天然环境中的行为，这在以往的结构生物学研究中较为罕见。此外，这些研究结果也对其他膜蛋白的动态结构分析具有重要的参考价值。

综上所述，本研究通过原位ssNMR技术成功解析了< i>BjSemiSWEET在细胞膜中的两种功能构象，并揭示了其在不同膜环境中的构象动态差异。这些发现不仅拓展了我们对膜蛋白运输机制的理解，也为探索细胞膜中其他膜蛋白的动态行为提供了新的研究思路。同时，本研究强调了在天然细胞膜环境中研究膜蛋白的重要性，以及原位ssNMR技术在解析膜蛋白动态结构中的潜力。这些成果有望推动动态细胞结构生物学的发展，并为相关领域的研究提供新的工具和方法。