一份转录组图谱，为豌豆的系统生物学研究提供了便利

《Crop Science》：A transcriptomic atlas facilitating systems biology approaches in pea

豌豆转录组图谱整合分析及稳定参考基因鉴定

　　随着农业和生物学研究的不断深入，豌豆（*Pisum sativum*）作为一种重要的农作物和经典的遗传学模型，正逐渐进入基因组学和系统生物学的研究领域。尽管RNA-测序（RNA-seq）已成为研究基因表达和转录组学的重要工具，但目前尚未有覆盖广泛生物条件的豌豆全基因组表达图谱。为此，本研究整合了149个公开的RNA-seq数据集，涵盖了10个不同品种的豌豆，以及多种植物器官和环境胁迫条件（包括高温、低温、营养和水分胁迫）。通过构建一个全面的转录组图谱，我们不仅验证了关键基因家族的表达模式，还进一步利用系统生物学方法分析了水分胁迫响应基因的调控网络，并从中预测了潜在的转录因子-靶基因相互作用。此外，我们还通过定量PCR（qPCR）验证了若干新的参考基因，这些基因在多种生物条件下表现出更稳定的表达水平。本研究的成果为豌豆及其作为豆科作物的系统生物学研究和基因组辅助育种策略提供了新的视角和资源。

豌豆自农业起源以来，一直是重要的作物之一，全球年种植面积超过1000万公顷，为人类提供了丰富的蛋白质、矿物质、淀粉和纤维，这些成分对健康具有显著益处。同时，作为豆科植物，豌豆具有固氮能力，能够提升土壤肥力，从而减少对化肥的依赖。自18世纪以来，豌豆因其在遗传学研究中的重要性而成为经典的模式生物，遗传学家格雷戈尔·孟德尔通过对豌豆的研究揭示了遗传规律的基本原理。然而，直到近年来，豌豆才真正进入“组学时代”，其参考基因组的发布为后续的基因组和转录组研究奠定了基础。本研究旨在利用这些基因组信息，构建一个全面的转录组图谱，以支持豌豆的系统生物学研究，并为农业育种提供新的工具。

为了构建这一转录组图谱，我们整合了来自多个国际研究的RNA-seq数据，涵盖了多种实验条件，包括不同的植物器官、非生物胁迫（如营养、水分和温度变化）以及生物胁迫（如根瘤形成）。通过这些数据，我们不仅获得了豌豆基因组中44,756个基因的表达信息，还揭示了它们在81种不同生物条件下的表达模式。这些数据被整合并存档于开放数据存储库Zenodo，为全球的研究者和育种专家提供了宝贵的资源。构建这样的图谱不仅有助于系统地理解基因表达模式，还能够支持多组学研究，如基因模块、调控网络和基因功能注释，从而为豌豆的基因组学研究和农业应用开辟新的途径。

在图谱构建过程中，我们首先通过热图可视化分析了糖转运蛋白和转录因子（TF）等关键基因家族的表达模式。热图分析不仅能够揭示基因在不同生物条件下的表达趋势，还能够通过层次聚类方法对样本进行分类。结果显示，大部分样本能够根据植物器官类型被清晰地分为四个主要簇（花、种子/荚、茎叶和根），这验证了图谱构建的准确性和可靠性。此外，我们还分析了糖转运蛋白家族的表达模式，发现某些基因在特定器官（如茎叶和种子）中表现出显著的高表达，这些基因可能在植物的碳分配过程中发挥重要作用。例如，糖转运蛋白*SUT1.1*和*SWEET12*在茎叶样本中表现出较高的表达水平，这与它们在韧皮部中参与糖分运输的功能一致。

为了进一步探索水分胁迫响应的调控机制，我们构建了一个基因共表达网络，利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）方法，将水分胁迫条件下根部表达变化的3684个基因与整个图谱中的其他基因进行关联分析。该网络包括44,364条连接边，揭示了水分胁迫响应基因之间的复杂调控关系。通过基因本体（GO）分析，我们发现这些基因主要参与膜运输、转录调控和核酸代谢等关键生物学过程。其中，两个基因（*Psat1g112600*和*Psat7g096040*）表现出最高的连接度，这表明它们可能在水分胁迫响应中扮演重要调控角色。我们还预测了88个可能参与水分胁迫响应的转录因子，其中基本亮氨酸拉链（bZIP）家族的*Psat5g257080*表现出最强的调控能力，这可能与干旱诱导的自噬过程有关。

在基因调控网络分析中，我们特别关注了与糖转运蛋白相关的转录因子。通过整合转录因子和糖转运蛋白的数据，我们构建了一个子网络，揭示了某些转录因子可能通过调控糖转运蛋白基因的表达来影响植物在水分胁迫下的碳分配策略。例如，*PsSTP13.2*和*PsSWEET6*被预测为与bZIP、G2-like和WRKY等转录因子相关联，这为理解植物如何通过调控糖转运蛋白来适应环境变化提供了新的线索。通过PlantPAN 4.0工具对这两个基因的启动子区域进行分析，我们发现了多个可能的调控元件，包括bZIP、G2-like和WRKY结合位点，这些结果进一步支持了我们的调控网络预测。

为了确保研究结果的可靠性，我们还通过定量PCR（qPCR）验证了图谱中筛选出的参考基因。参考基因在基因表达研究中具有重要作用，它们的表达水平在不同实验条件下保持稳定，从而能够作为标准化的基因用于后续分析。在豌豆中，常用的参考基因包括*TFIIA*、*PP2A*和*β-tubulin*，但这些基因的表达水平往往受到实验条件的影响，因此需要在每项研究中进行验证。本研究通过整合转录组数据，筛选出10个具有最低系数变化（CV）值的基因，并利用多种算法（如BestKeeper、delta-Ct、geNorm、NormFinder和RefFinder）对其表达稳定性进行了综合评估。结果显示，*Psat6g102320*、*Psat6g163160*和*Psat7g253080*在多种实验条件下表现出更高的稳定性，优于传统的参考基因。这些新发现的参考基因有望成为豌豆研究中的重要工具，提高qPCR实验的准确性。

本研究不仅为豌豆的基因组学和系统生物学研究提供了新的资源，还为农业育种提供了重要的支持。通过整合多组学数据，我们能够更全面地理解基因在不同环境条件下的表达模式和调控机制，从而为开发具有抗逆性的豌豆品种提供理论依据。此外，参考基因的发现和验证为定量PCR实验的标准化提供了新的选择，有助于提高研究结果的可比性和可靠性。这些成果不仅推动了豌豆的科学研究，也为豆科作物的遗传改良和农业应用提供了新的方向。未来，随着更多组学数据的积累和系统生物学方法的进一步发展，豌豆的基因组学研究将不断深入，为应对气候变化和提高作物产量提供更有力的工具。