利用锁定核酸和阻断探针提高特异性，通过定量PCR技术检测环境DNA中的濒危鱼类Crystallaria Cincotta

《Conservation Genetics Resources》：Quantitative PCR detection of endangered diamond darter Crystallaria Cincotta in environmental DNA: employing locked nucleic acids and blocking probe for specificity

定量PCR方法通过线粒体细胞色素b基因设计，利用LNA富集探针和次级阻断探针增强特异性，成功检测濒危钻石石斑鱼eDNA，验证无交叉反应，并评估了灵敏度等性能指标。

　　

摘要

本研究介绍了一种定量PCR（qPCR）检测方法，用于从水样中的环境DNA（eDNA）中识别濒危鱼类Crystallaria cincotta。该检测方法的设计基于58个个体（代表25种鲈科鱼类）的线粒体细胞色素b DNA序列比对结果。利用这些遗传差异，研究人员开发出了一种物种特异性的qPCR检测方法，该方法使用了富含锁定核酸（LNA）的探针和二级阻断探针以提高检测特异性。该检测方法针对一个包含诊断性单核苷酸多态性的93个碱基对片段；结合多个引物错配位点，能够有效区分C. cincotta与其他同域分布的鲈科鱼类。通过检测16种鲈科鱼类的基因组DNA及合成模板，验证了该方法的特异性，确认不存在交叉反应现象。文中报告了包括标准曲线、qPCR效率、检测限和定量限在内的性能指标。实验结果表明，该qPCR方法具有足够的灵敏度，能够在从鱼类栖息地采集的环境水样中检测到C. cincotta的eDNA。本研究展示了富含LNA的探针和阻断探针在开发用于eDNA检测的物种特异性qPCR检测方法中的有效性，证明了它们在区分多样化鱼类群落中亲缘关系密切的物种方面的实用性。