胶原纤维的双向排列结构有助于引导3D打印结构中细胞的排列方向

《Acta Oecologica》：Dual-orientation of collagen fibers to guide cell alignment in 3D-printed constructs

本文提出一种挤出式3D打印方法，通过控制挤出速率和打印头运动速度比，实现胶原蛋白纤维在平行和垂直于打印方向的精确对齐，并成功指导角膜成纤维细胞定向排列。

　　这项研究由Diya Singhal、Fotis Christakopoulos、Lucia G. Brunel、Suraj Borkar、Vanessa M. Doulames、Esther A.T. Mozipo、David Myung和Gerald G. Fuller等人共同完成，他们来自斯坦福大学化学工程系。研究的核心在于开发一种能够再现的3D打印方法，以制造具有二维方向纤维对齐模式的仿生支架。这项工作填补了当前技术在制造多方向纤维对齐结构方面的空白，为组织工程提供了新的可能性。

自然组织通常由具有复杂纤维排列模式的纤维状蛋白组成，这些排列模式对于细胞行为的引导至关重要。例如，角膜中的细胞外基质（ECM）含有正交排列的胶原纤维束，能够有效地传递光线并保持机械强度。而在关节软骨中，胶原纤维的排列呈现出深度依赖性：表层区域的纤维平行于表面，过渡层则呈现更各向同性的分布，深层区域的纤维则垂直于表面，锚定在钙化的软骨中。这些区域性的排列不仅限制了组织的膨胀，还促进了渗透压作用以承载负荷，并赋予组织压缩性和剪切阻力。动脉中的胶原纤维则主要以螺旋形式排列，从而在环向和轴向方向上增强血管的结构。

然而，目前大多数的制造方法只能实现单一方向的纤维对齐，这在一定程度上限制了其在组织工程中的应用。因此，研究团队提出了一种基于挤出的3D打印策略，旨在实现胶原纤维在两个独立方向上的精确控制。这种策略允许在单一结构中实现空间上模式化的多方向胶原纤维对齐，从而引导角膜间质细胞在多个方向上对齐。与传统的制造方法相比，这种策略具有更高的空间控制精度，并且能够在打印过程中实现连续的纤维对齐模式，而无需改变喷头轨迹或依赖外部磁场、复杂设备改造或材料添加剂。

研究团队首先提出了一个理论模型，用于预测不同的打印参数如何影响打印丝的横向扩散。接着，他们系统地评估了所使用的挤出式3D打印机的打印参数，并量化了不同条件下的胶原纤维对齐模式。这些实验观察结果验证了他们的理论预测，并使他们能够定义每种纤维对齐模式对应的打印参数。随后，他们展示了这些平行和垂直对齐的胶原基质如何引导细胞的扩展形态。通过这种新的打印策略，他们成功制造了具有双方向胶原纤维对齐的样品，这表明该方法能够实现可预测、可再现和可扩展的仿生结构制造，从而精确模拟天然组织的各向异性结构。

此外，研究团队还考虑了如何在实际应用中提高打印的精度和稳定性。他们发现，打印头的移动速度与墨水挤出速度之间的比率是决定胶原纤维对齐的关键因素。通过控制这一比率，可以在单次打印过程中实现胶原纤维的平行和垂直对齐。这种技术不仅适用于在空气中打印的丝状结构，也适用于在支撑浴中进行嵌入式打印，从而制造出具有对齐胶原纤维的三维结构。这为组织工程提供了一种新的工具，能够制造出具有复杂纤维排列的支架，进而影响细胞的行为。

在实验过程中，研究团队还对胶原墨水的流变性能进行了评估。他们发现，胶原墨水在特定的温度和pH条件下能够形成稳定的纤维网络。通过调整这些条件，可以优化墨水的流变特性，从而提高打印过程中纤维对齐的可控性。此外，他们还测试了不同打印参数对纤维对齐的影响，包括挤出速度、喷头移动速度以及打印路径的设计。这些参数的调整不仅影响纤维的对齐方向，还影响纤维的排列密度和结构完整性。

研究团队还探讨了如何在实际应用中克服现有技术的局限性。例如，传统的挤出式3D打印方法通常只能实现单一方向的纤维对齐，而无法在同一个打印路径中实现多方向的对齐。此外，许多现有的制造方法依赖于离散的、逐层沉积的策略来交替纤维对齐方向，这可能导致打印过程中出现纤维之间的间隙和不连续性。而频繁地抬起和重新定位喷头则会中断材料流动，降低对纤维对齐的控制精度，并可能影响打印的完整性。

为了解决这些问题，研究团队提出了一种新的打印策略，即通过调整打印参数，使胶原纤维在同一个打印路径中实现平行和垂直对齐。这种策略的关键在于在打印过程中控制墨水的横向扩散，从而在不改变喷头轨迹的情况下实现纤维对齐的转换。这种方法不仅提高了打印的精度，还使得制造具有复杂纤维排列的支架成为可能。同时，它也避免了对外部磁场、复杂设备改造或材料添加剂的依赖，从而提高了制造过程的可操作性和兼容性。

在实际应用中，这种技术能够广泛用于制造具有高空间精度的组织仿生结构。例如，它可以用于制造具有不同纤维排列模式的角膜支架，以模拟天然角膜的结构。此外，它还可以用于制造具有复杂纤维排列的软骨支架，以模拟关节软骨的深度依赖性排列。这种技术的灵活性使得它能够适应不同类型的组织工程需求，并为未来的生物打印研究提供了新的方向。

研究团队还对这种技术的潜在应用进行了展望。他们认为，这种基于挤出的3D打印方法不仅适用于制造胶原支架，还可以用于制造其他类型的生物材料支架。例如，它可以通过调整打印参数，实现不同纤维材料的对齐控制，从而制造出具有不同机械性能和生物功能的支架。此外，这种方法还可以与其他生物打印技术相结合，以进一步提高支架的复杂性和功能性。

总的来说，这项研究为组织工程提供了一种新的方法，使制造具有多方向纤维对齐的支架成为可能。通过调整打印参数，研究团队能够在不改变喷头轨迹的情况下实现纤维对齐的转换，从而制造出具有复杂纤维排列的仿生结构。这种方法不仅提高了打印的精度和稳定性，还避免了对复杂设备和外部条件的依赖，使得其在实际应用中更加可行。此外，这种方法的兼容性和灵活性使其能够广泛应用于不同的组织工程研究，为未来的生物打印技术发展提供了重要的参考。