Synphilin-1调控α-突触核蛋白组装、释放与摄取的新机制及其在帕金森病中的作用研究

《npj Parkinson's Disease》：Synphilin-1 modulates alpha-synuclein assembly, release and uptake

本文聚焦帕金森病（PD）中α-突触核蛋白（aSyn）异常聚集的分子机制，研究人员通过构建Synphilin-1（Sph1）与aSyn的双分子荧光互补（BiFC）细胞模型，系统解析了Sph1在调控aSyn液-凝胶相分离、包涵体形成及细胞间传播中的关键作用。研究发现Sph1可促进aSyn形成凝胶样凝聚体，并捕获溶酶体及AP-1囊泡，进而抑制aSyn的细胞外释放。该研究为理解突触核蛋白病的病理进程提供了新视角，并为靶向Sph1-aSyn相互作用的治疗策略奠定理论基础。

　　

在帕金森病（Parkinson's disease, PD）和其他突触核蛋白病（synucleinopathies）中，α-突触核蛋白（alpha-synuclein, aSyn）的异常聚集是标志性的病理特征。aSyn是一种天然无序蛋白（intrinsically disordered protein），在生理状态下参与突触囊泡运输等过程，但其如何从可溶性单体转变为有毒性的寡聚体或纤维状聚集体，进而形成路易体（Lewy bodies, LBs）和路易神经突（Lewy neurites, LNs），这一过程的具体分子机制尚不明确。传统的细胞和动物模型往往需要借助化学诱导剂或过表达手段才能触发aSyn聚集，且难以真实模拟病理条件下包涵体的动态形成过程，这限制了对疾病早期机制的深入理解。因此，开发能够实时、直观反映aSyn在活细胞中聚集动态的新模型，并寻找调控该过程的关键因子，成为领域内的重要挑战。

为解决上述问题，研究人员在《npj Parkinson's Disease》上发表了最新研究，他们重点关注了aSyn的相互作用蛋白——Synphilin-1（Sph1）。Sph1早在1999年就被发现可与aSyn结合，并共同存在于路易体中，但其在aSyn聚集通路中的具体功能一直未被阐明。本研究创新性地利用双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）技术，构建了VN-Sph1与aSyn-VC共表达的细胞模型，首次在活细胞中实时观测到由Sph1触发的aSyn胞质包涵体形成过程。该模型无需外源添加预形成纤维（pre-formed fibrils, PFFs）或化学应激物，即可自发形成包涵体，为研究aSyn的生理性聚集提供了强大工具。

研究团队运用了多项关键技术：包括双分子荧光互补（BiFC）技术用于实时可视化蛋白质相互作用和包涵体形成；荧光漂白恢复（FRAP）技术用于分析包涵体内蛋白质的流动性和相态特性；活细胞成像技术用于观察包涵体的动态融合与分裂过程；蛋白质印迹（Western blot）、天然PAGE和蛋白激酶K（Proteinase K, PK）消化实验用于评估聚集体的生化特性；尺寸排阻色谱（SEC-HPLC）结合斑点杂交（dot blot）用于分析蛋白质组装体的大小分布；α-突触核蛋白种子扩增实验（Seed Amplification Assay, SAA/RT-QuIC）用于定量评估Sph1对aSyn聚集的催化活性；细胞共培养实验和酶联免疫吸附试验（ELISA）用于研究aSyn的细胞间传播；此外，还使用了人胚胎肾293（HEK）细胞、H4神经胶质瘤细胞以及原代皮质和海马神经元等多种细胞模型。

VN-Sph1+ aSyn-VC相互作用导致胞质包涵体形成且不影响细胞稳态

研究人员发现，与单独表达aSyn BiFC（VN-aSyn + aSyn-VC）时荧光信号弥散分布不同，共表达VN-Sph1和aSyn-VC可在HEK 293细胞和原代神经元中高效形成明显的胞质包涵体。这些包涵体呈圆形或管状，且其形成不引起细胞膜完整性受损或细胞活力下降等毒性效应。有趣的是，Sph1的表达反而缓解了由aSyn过表达引起的高尔基体碎片化现象，表明Sph1可能在一定程度上减轻了aSyn相关的细胞应激。

VN-Sph1+ aSyn-VC组装体具有有限的聚集倾向和改变的结构稳定性

生化分析显示，VN-Sph1+aSyn-VC形成的包涵体在天然条件下仅产生微弱的聚集态aSyn信号，且对蛋白激酶K的消化抗性低于aSyn BiFC形成的聚集体。尺寸排阻色谱分析也未检测到高分子量的aSyn物种显著增加，提示VN-Sph1+aSyn-VC包涵体可能代表一种非经典的高度有序纤维结构，而是处于相变或非晶态蛋白状态。

VN-Sph1+ aSyn-VC包涵体是水凝胶样的相分离组装体

通过荧光漂白恢复（FRAP）实验，研究人员分析了包涵体内蛋白质的流动性。结果显示，VN-Sph1+aSyn-VC包涵体的荧光恢复半衰期显著长于弥散状态的信号，但快于Sph1同源二聚化形成的几乎不动的包涵体。这种中间态的流动性表明VN-Sph1+aSyn-VC包涵体具有凝胶样（gel-like）特性，其内部蛋白质分子具有一定运动能力，能够发生融合行为。活细胞成像也观察到小包涵体可通过融合形成更大聚集体，进一步支持其类液体冷凝物特性。用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺处理可使包涵体流动性增加，但24小时后仍不能完全溶解，说明其具有一定的稳定性。

溶酶体和AP-1定位于VN-Sph1+ aSyn-VC组装体内

深入观察发现，VN-Sph1+aSyn-VC包涵体内嵌有特定的细胞器。虽然线粒体等细胞器仅位于包涵体附近或穿过其中，但来自高尔基体反式网状结构（trans-Golgi network, TGN）的AP-1（Adaptor protein-1）标记的囊泡和溶酶体标记蛋白LAMP1阳性的细胞器被捕获在包涵体内部。这表明Sph1-aSyn组装体的形成可能干扰了起源于TGN的正常膜运输过程，特别是与降解和分泌相关的通路。

Sph1在aSyn聚集过程中起重要作用

通过调节Sph1和aSyn的表达比例，研究发现高表达Sph1倾向于形成单个管状包涵体，而高表达aSyn则促进形成多个小包涵体，表明Sph1是聚集过程的主要驱动者。利用种子扩增实验（SAA）证实，含有Sph1的细胞裂解液能显著加速单体aSyn形成纤维，缩短反应的滞后期。此外，突变Sph1中与aSyn相互作用的关键残基（如K527A）可显著减少包涵体形成。而过表达分子伴侣Hsp70能特异性减少VN-Sph1+aSyn-VC包涵体的数量和面积，提示分子伴侣系统可动态调控这一聚集过程。

Sph1调控aSyn的释放和摄取

细胞共培养实验表明，当供体细胞或受体细胞表达Sph1时，aSyn BiFC阳性细胞（指示aSyn发生相互作用/聚集）的数量减少。同时，培养基中aSyn的ELISA检测量也显著降低，说明Sph1的存在减少了aSyn向细胞外的释放。在另一个aSyn聚集模型（SynT）中，共表达Sph1同样降低了培养基中的aSyn水平。这些结果提示，Sph1促进的胞内包涵体形成可能作为一种隔离机制，限制了aSyn的细胞间传播。

结论与讨论

本研究成功开发了一个基于Sph1与aSyn相互作用的活细胞模型，用于研究aSyn的聚集动力学。结果表明，Sph1是aSyn组装和包涵体形成的关键调控因子。Sph1可能作为支架蛋白，通过其卷曲螺旋结构域招募aSyn，引发液-液相分离（LLPS），并促使形成的冷凝物向凝胶态成熟。这些凝胶样包涵体能够捕获AP-1囊泡和溶酶体，可能扰乱TGN来源的运输，这为理解帕金森病早期出现的运输功能障碍提供了线索。同时，包涵体的形成将aSyn隔离在胞内，减少了其细胞外释放和传播，这可能是一种初始的细胞自我保护机制，但包涵体的长期存在也可能最终损害细胞功能。研究还发现分子伴侣Hsp70能调控这一过程，突显了蛋白质稳态网络在aSyn聚集中的重要作用。Sph1作为一个与多个帕金森病相关蛋白（如Parkin、PINK1、LRRK2）相互作用的分子枢纽，其功能可能不仅限于aSyn病理。该研究深化了对突触核蛋白病分子机制的理解，并提示靶向Sph1-aSyn相互作用可能成为干预疾病进展的新策略。