复合水凝胶-微球递送系统通过依次释放NGF和Yoda1，促进早期由神经介导的骨再生以及后期由机械转导驱动的骨重塑过程

《Bioactive Materials》：Composite hydrogel-microsphere delivery system promotes early nerve-mediated bone regeneration and late-stage mechanotransduction-driven bone remodeling via sequential release of NGF and Yoda1

骨修复中神经调节与机械转导的协同作用及递送系统研究。

　　这项研究探讨了一种新型的复合材料递送系统，该系统利用GelMA水凝胶和PLA微球的协同作用，实现了骨修复过程中神经调控因子和机械信号的序贯释放。骨缺损是临床治疗中一个重要的挑战，尤其是在因严重创伤、肿瘤切除或感染导致的大型骨缺损，这类情况往往超出骨骼自身的修复能力，因此需要借助骨移植手术。然而，传统自体或异体骨移植存在诸如供体短缺、术后并发症（如免疫排斥、感染和供体部位损伤）等问题，促使研究人员探索骨替代材料。骨再生是一个复杂的生理过程，涉及神经、血管、免疫细胞和干细胞之间的相互作用。现代材料通过增强微观特性、整合细胞因子和种子细胞、以及应用纳米技术，已取得一定进展。然而，当前的骨组织工程研究主要集中在调控干细胞的成骨作用，常常忽视神经调控的潜在价值，这可能影响骨修复的最佳效果。因此，开发一种能够同时促进神经再生、血管生成和骨再生的多功能仿生材料，成为研究的重要方向。

神经系统对骨稳态具有显著影响，临床观察表明，感觉神经损伤会导致骨量显著减少和骨折愈合延迟。脑损伤患者骨折愈合时间缩短，这与血清中神经生长因子（NGF）水平升高有关，同时增加了异位骨化风险。近年来的研究强调了神经营养信号、疼痛保护和血流调节在神经控制骨健康中的关键作用。神经元通过释放如NGF和脑源性神经营养因子（BDNF）等神经营养因子，以及生物活性物质如降钙素基因相关肽（CGRP）、物质P（SP）和血管活性肠肽（VIP），调节骨修复微环境。NGF对于骨折愈合至关重要，通常在骨折后3天内局部达到峰值。NGF可能通过TrkA-Sema3A通路增强局部轴突调节，提高神经肽表达、细胞因子水平、感觉神经支配密度，影响成骨细胞与破骨细胞的平衡，从而促进骨再生和血管化。CGRP作为一种广泛研究的神经肽，在兔下颌损伤模型中，其表达在伤后第14天达到高峰，与从炎症到新骨再生的阶段相吻合。这些发现表明，感觉神经系统在骨损伤后具有早期反应，各种神经因子具有精确的时间和空间表达模式。神经、血管和干细胞之间的相互作用建立了一个有利于骨再生的微环境，这对于有效的骨修复至关重要。

机械转导是生物体检测和响应机械刺激的重要生理过程。Piezo1通道蛋白在多种组织和器官中发挥关键作用，特别是在骨骼系统中，它对于骨发育调节和机械应力引起的骨稳态维持至关重要。Piezo1能够检测细胞膜上的机械信号，如应力、应变和剪切力，通过钙离子内流激活下游信号通路，从而调节成骨细胞的活动。研究表明，Piezo1的表达水平与骨形成密切相关，骨质疏松症患者的表达水平降低，而成骨细胞中Piezo1的缺失会导致骨量和骨强度下降。相反，机械刺激诱导的Piezo1激活可以增强成骨细胞的成骨活性。除了骨骼系统，Piezo1在神经、血管和肌肉中广泛表达，参与多种生理过程。在神经系统中，Piezo1的敲低促进神经干细胞向少突胶质细胞分化，而非神经元分化。Piezo1的激活还促进血管生成，这对于血管生成-成骨耦合和骨重建至关重要。然而，大型骨缺损患者常常面临早期机械刺激不足的问题。开发如Yoda1这样的Piezo1化学激活剂，可以减少对机械刺激的依赖，为治疗大型骨缺损提供潜在的治疗策略。不过，Piezo1激活具有组织特异性，全身使用Yoda1可能导致多器官副作用，包括加速骨关节炎的发展。因此，设计精准的靶向调控策略是必要的。设计局部药物递送系统，以避免全身影响并实现骨缺损部位的特定Piezo1激活，对于骨缺损治疗显得尤为重要。

水凝胶在骨修复材料中展现出巨大的潜力，因其具有类似细胞外基质的结构和良好的生物相容性。GelMA（明胶甲基丙烯酰基）作为一种代表性光交联水凝胶，结合了天然和合成材料的优点。其三维多孔结构富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）基团，有助于细胞的黏附和分化。GelMA还提供了可调节的降解特性、机械特性以及热敏凝胶特性。这些特性使其能够有效模拟天然骨基质微环境，支持成骨分化和血管化，使其成为骨组织工程的理想候选材料。然而，单一GelMA水凝胶的成骨潜力有限，因此需要通过添加活性化合物来增强其性能。水凝胶的亲水性交联网络不仅维持了仿生微环境，还充当了生长因子的保护载体。这种特性使水凝胶能够通过扩散途径实现生物活性分子的可控释放，为安全有效的递送系统奠定了基础。为了应对骨再生过程中复杂信号网络的精准调控需求，当前研究旨在将水凝胶从简单的载体转变为智能递送平台。理解骨修复过程中各种因子的时空释放动态，已经催生了五种策略：基于亲和力的递送、载体辅助递送、应激响应递送、基于空间结构的递送和基于细胞系统的递送。通过将生长因子或药物加载到水凝胶基质或微球（也称为微载体）中，可以实现不同的释放曲线。调整微球的比例不仅扩大了GelMA的孔隙结构，还提供了高表面积与体积比，促进细胞迁移、营养交换和细胞生长空间的扩展。微球具有保持药物活性、优秀的药物装载能力、高封装效率和初始药物释放控制等优势。可降解聚合物如聚乳酸（PLA）由于其可调节的降解速率、优异的机械性能和低疾病传播风险，成为骨组织工程中微球制备的优选材料。这种智能时空递送方法能够准确模拟自然骨再生过程，为骨修复提供了一种有前景的解决方案。

本研究开发了一种复合水凝胶-微球递送系统，该系统包含GelMA水凝胶和PLA微球，能够实现生长因子/药物的快速释放和延迟释放。Yoda1作为一种Piezo1的化学激动剂，被封装在PLA微球中，并随后整合到GelMA水凝胶中形成复合水凝胶。NGF则通过非共价相互作用加载到GelMA上，并通过水凝胶网络的扩散释放。快速释放的NGF促进了骨缺损部位的早期神经血管化，而Yoda1封装在PLA中导致其具有持续释放特性，主要作用于骨修复的中后期。体外评估显示，该复合水凝胶系统增强了RSC96的迁移和成熟，并诱导PC-12的神经样分化，从而促进成骨和血管生成。在皮下植入模型和股骨缺损模型中，均观察到复合水凝胶-微球系统促进早期神经支配、类型H血管形成和骨再生，以及后期骨重塑。因此，我们设计的复合序贯调控递送系统为实现精准骨再生提供了一种有前景的策略。

本研究中，通过不同的微球浓度（0、50、150、250毫克）制备了GelMA/PLA@Yoda1复合水凝胶，以确定最佳的药物释放模式。实验结果表明，不同微球浓度对水凝胶的特性产生了显著影响。接触角测试显示，随着微球浓度的增加，接触角从36.6±13.1度增加到71.2±10.8度，这可能与PLA微球中酯基团的疏水性有关。机械测试显示，加载微球的复合水凝胶表现出更优的机械性能，60%应变下的应力分别为109.97±6.10千帕、207.17±33.89千帕、238.97±32.92千帕和143.87±27.68千帕。然而，在5毫克/毫升微球浓度下，机械性能有所下降，这可能与水凝胶孔隙的增大有关。吸水实验显示，水凝胶在约16小时达到平衡，其吸水率分别为489.2±79.9%、697.0±57.4%、641.1±41.8%和842.0±86.4%。降解实验表明，不同微球浓度的复合水凝胶表现出均匀且缓慢的降解模式，但前7天的降解速率比之后14天更快，这可能部分解释了NGF的快速释放。扫描电子显微镜（SEM）和能谱分析（EDS）显示，G/P@Yoda1复合水凝胶呈现出多孔网络结构，其中可见嵌入的PLA@Yoda1微球，表明其具备良好的结构特性。不同视野下的孔隙大小分别为139.4±54.7微米、442.2±101.2微米、384.2±73.6微米和598.8±184.5微米，有助于细胞附着。在1和3毫克/毫升微球浓度下，微球扩展了水凝胶的孔隙结构，提高了平均孔隙大小。然而，在5毫克/毫升浓度下，高微球浓度破坏了网络结构，导致平均孔隙大小显著增加。EDS确认了Yoda1的特征元素S和Cl在G/P@Yoda1复合水凝胶中存在，表明Yoda1成功封装在PLA微球中。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析显示，复合水凝胶中同时存在Yoda1（C-Cl伸缩振动峰在619厘米-1）和GelMA（酰胺III带特征峰在1255厘米-1）的吸收峰，且在5毫克/毫升浓度下C-Cl伸缩振动最强且无峰位移动，表明PLA@Yoda1微球成功封装在水凝胶中。通过乙醇置换法测定的水凝胶孔隙率分别为71.51±4.32%、74.73±5.57%、70.60±7.17%和79.55±5.39%，满足了骨生长的需要。

随后，我们评估了G/P@Yoda1复合水凝胶中Yoda1的持续释放性能。实验结果表明，Yoda1在初期释放量很小，随后在14天后呈现一致且渐进的释放曲线。Yoda1的封装效率和加载效率分别为96.98±1.34%和0.48±0.01%，表明Yoda1的利用效率较高。通过30天的累积浓度分析，Yoda1在不同微球浓度下的浓度分别为1.47±0.41微克/毫升、4.43±0.66微克/毫升和7.70±0.66微克/毫升。累积释放量分别为0.088±0.025微克、0.266±0.040微克和0.462±0.039微克，对应的释放百分比分别为30.23±8.06%、30.44±4.24%和31.99±3.18%，表明没有出现爆发性释放现象，从而降低了晚期毒性风险。最后，我们对NGF从NGF-G/P@Yoda1水凝胶中的释放曲线进行了表征。结果显示，无论初始NGF加载浓度如何，所有组均表现出初始快速释放阶段。前五天被定义为爆发释放阶段，计算的爆发百分比分别为79.7±4.5%（25纳克/毫升）、79.6±2.6%（50纳克/毫升）、83.8±0.9%（100纳克/毫升）、83.9±1.8%（200纳克/毫升）和83.6±0.7%（400纳克/毫升）。这种释放模式与之前报告的骨损伤后NGF水平迅速上升相一致。此外，还报告了NGF的加载效率和30天内累积释放量。

为了确定Yoda1的最佳浓度以促进BMSCs的成骨作用，我们进行了剂量反应实验。结果表明，Yoda1浓度超过8微克/毫升可能对BMSCs的活性和成骨潜力产生不利影响。相反，在浓度达到4微克/毫升时，Yoda1表现出剂量依赖性的促成骨作用，而浓度达到6微克/毫升则被认为相对安全。为了模拟Yoda1在G/P@Yoda1复合水凝胶中持续释放的体内累积药物效应，我们使用了30天持续释放的培养基进行细胞毒性和BMSCs成骨实验。活/死染色和CCK-8细胞毒性实验显示，5毫克/毫升微球浓度的G/P@Yoda1复合水凝胶对RSC96和HUVECs表现出显著的毒性。结合Yoda1的释放曲线，这一发现与8微克/毫升Yoda1浓度下BMSCs活性下降的现象相吻合。此外，我们还建立了阴性对照组（3毫克/毫升+Dooku1），以确认Yoda1对Piezo1通道激活的特异性。更进一步，Western blot分析显示，在3毫克/毫升组中，BMSCs的p-CaMKII、β-catenin、RUNX2和COL1A蛋白表达显著上调，而p-YAP1的表达则下调。这一效应被Dooku1所抑制。这些结果表明，Yoda1通过激活Piezo1通道引发钙离子内流，调节下游YAP1/β-catenin信号通路，从而介导BMSCs的成骨作用。因此，基于对生物安全性和成骨效果的综合分析，我们选择了3毫克/毫升的微球浓度来制备NGF-G/P@Yoda1复合水凝胶。

为了确定NGF的最佳浓度以促进PC-12的神经元分化，我们首先进行了剂量反应实验。结果表明，100纳克/毫升的NGF浓度对PC-12神经突起的生长促进最为显著。因此，维持初始NGF浓度在50至100纳克/毫升之间是更具成本效益的策略。此外，这种效应被TrkA抑制剂有效阻断，确认了NGF通过TrkA信号通路特异性促进PC-12的神经元分化。考虑到有效工作浓度和成本效益，最终选择了200纳克/毫升的NGF加载浓度来制备NGF-G/P@Yoda1复合水凝胶。

由于Schwann细胞在神经再生中的关键作用，我们建立了Schwann细胞与复合水凝胶的共培养系统。通过Transwell和伤口愈合实验评估了复合水凝胶对Schwann细胞迁移的影响。实验结果表明，NGF-G/P和NGF-G/P@Yoda1组显著增强了RSC96的迁移能力，相较于空白组、G/P组和G/P@Yoda1组，这是由于NGF从NGF-G/P@Yoda1中快速释放所导致的神经营养特性。虽然Yoda1也表现出神经营养作用，但G/P组与G/P@Yoda1组之间、NGF-G/P组与NGF-G/P@Yoda1组之间未观察到显著差异，这可能归因于Yoda1的延迟释放特性。随后，我们使用免疫荧光（IF）染色评估了复合水凝胶的神经诱导能力。结果表明，与G/P和G/P@Yoda1组相比，NGF-G/P和NGF-G/P@Yoda1组中的RSC96表现出更长的轴突延伸，形态呈纺锤形，而其他组则呈现球形或短纺锤形。TUBB3，作为神经元微管的主要成分，对于轴突引导、成熟和维持至关重要，其在PC-12与NGF-G/P或NGF-G/P@Yoda1共培养时表达增加，伴随显著的神经突延长。其他组仅表现出短而分散的神经突。CGRP，一种由神经元轴突释放的关键神经递质，具有包括免疫调节、成骨和血管生成在内的多种生物学功能，在骨稳态中起着关键作用。IF染色结果表明，NGF-G/P和NGF-G/P@Yoda1组显著上调了CGRP的表达，其分布沿神经突与TUBB3表达模式一致。总体而言，NGF从NGF-G/P@Yoda1中的快速释放促进了最佳的神经诱导，这可能影响随后的血管-成骨过程。

为了研究NGF-G/P@Yoda1通过神经诱导对成骨和血管生成的影响，我们建立了体外共培养模型，包括RSC96/PC-12与复合水凝胶。共培养5天后收集的条件培养基用于培养BMSCs和HUVECs。ALP和ARS染色结果表明，NGF-G/P@Yoda1组表现出更优的ALP活性和钙结节形成能力。与未接受条件培养基干预的空白组相比，NC组、G/P组和G/P@Yoda1组均显示出增强的性能。值得注意的是，尽管在ALP活性方面未观察到显著差异，但G/P@Yoda1组表现出比G/P组更高的钙结节沉积，这可能归因于诱导时间的延长。尽管初期释放的Yoda1量较少，但长期诱导可能导致微量Yoda1的累积效应。然而，这种微量Yoda1的累积效应不足以在NGF-G/P和NGF-G/P@Yoda1组之间产生显著差异。与ALP染色结果一致，IF染色显示NGF-G/P和NGF-G/P@Yoda1组显著上调了成骨分化相关蛋白OPN和COL1A的表达。这些发现表明，神经调节能够有效刺激BMSCs的成骨潜力，而这种效应在NGF-G/P@Yoda1中被快速释放的NGF进一步增强。更重要的是，Western blot分析显示，当BMSCs接受NGF-G/P和NGF-G/P@Yoda1共培养的条件培养基处理时，CALCRL、RAMP1、CRCP、PRKACB、p-CREB1、RUNX2和COL1A蛋白表达水平最高。而其他实验组的表达水平虽高于空白组，但G/P组和G/P@Yoda1组之间未观察到显著差异。这些结果表明，共培养培养基中CGRP与BMSCs上的CGRP受体（由CALCRL和RAMP1组成）结合，引发细胞内信号传递，其中CRCP促进cAMP传递，从而激活下游PKA/CREB信号通路，最终促进成骨。

为了进一步评估NGF-G/P@Yoda1对血管生成和胶原纤维生长的影响，我们进行了伤口愈合实验。结果显示，NGF-G/P和NGF-G/P@Yoda1组在12小时后的迁移比分别为0.43±0.03和0.41±0.02，显著高于其他组。与未接受共培养培养基处理的空白组相比，NC组、G/P组和G/P@Yoda1组均表现出更高的愈合比。这些结果与体外实验结果一致，表明神经调节能够增强血管生成，而建立的神经血管微环境网络有助于启动骨修复过程。此外，管形成实验显示，NGF-G/P和NGF-G/P@Yoda1组在6和12小时后显示出显著增加的节点和管数量。这些结果表明，神经调节可以增强血管生成，而神经血管微环境的建立可能对骨修复起着关键作用。

为了评估NGF-G/P@Yoda1在皮下植入模型中对神经和组织诱导的影响，我们进行了免疫荧光（IF）染色。结果表明，NGF-G/P和NGF-G/P@Yoda1组在2周内促进了神经、血管和部分胶原纤维的早期生长。H&E和Masson染色显示，NGF-G/P和NGF-G/P@Yoda1组的水凝胶网络中成功渗透了胶原纤维。相比之下，G/P@Yoda1组仅显示出零星细胞，没有组织生长。为了评估NGF-G/P@Yoda1的神经诱导潜力，我们进行了TUBB3和CGRP的IF染色。结果显示，只有NGF-G/P和NGF-G/P@Yoda1组在水凝胶网络中显示出显著的TUBB3和CGRP信号，且其分布模式紧密关联，表明其可能诱导感觉神经支配。为了评估NGF-G/P@Yoda1对血管生成和胶原纤维生长的影响，我们进行了CD31和COL1A的IF染色。同样，结果表明G/P和G/P@Yoda1组在水凝胶网络中显示出极低的新生血管和胶原形成信号。而NGF-G/P和NGF-G/P@Yoda1组则显示出显著的CD31和COL1A荧光信号，其分布模式显示中心血管形成被胶原纤维包围，尽管缺乏显著共定位。此外，IF染色显示所有组在周围组织中IL-1β的分布水平相似，没有统计学上的显著差异。这表明本研究中开发的复合系统表现出良好的生物相容性。

在股骨缺损模型中，我们进一步评估了NGF-G/P@Yoda1对骨再生和骨重塑的影响。微CT分析显示，NGF-G/P@Yoda1显著促进了骨缺损修复。与NC和G/P组相比，G/P@Yoda1和NGF-G/P@Yoda1组在4和8周后显示出显著改善的骨再生参数，包括增加的骨矿密度（BMD）、骨体积/总体积比（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th），以及减少的骨小梁分离（Tb.Sp）。与自体骨移植组（Autograft组）相比，NGF-G/P@Yoda1组在8周后实现了几乎相同的骨修复结果。尽管Autograft组在4周时显示出更高的BV/TV值，但这一结果是可以理解的，因为自体骨作为临床骨缺损治疗的标准，具有最佳的三维多孔结构、成骨诱导性和成骨传导性。此外，它可以通过快速骨整合直接与宿主骨床建立结构和功能连接。在4周时，NGF-G/P@Yoda1组在所有参数上均优于G/P@Yoda1组，而在8周时，G/P@Yoda1组和NGF-G/P@Yoda1组在BV/TV、Tb.N和Tb.Th方面无显著差异。这表明，复合水凝胶中持续延迟释放的Yoda1可能有助于减少G/P@Yoda1和NGF-G/P@Yoda1在中后期骨成骨和骨小梁重塑特性上的差异。此外，NGF-G/P组在4周时的骨修复程度与G/P@Yoda1组相当，但其BMD和Tb.Th在8周时显著低于G/P@Yoda1组。这一时间模式与NGF和Yoda1在骨修复中的不同作用相一致：NGF的早期快速释放促进了快速的神经介导骨再生，而Yoda1的持续释放在中后期不仅促进骨再生，还对骨强度成熟起着关键作用，从而在BMD和Tb.Th方面表现出优越性。此外，NGF-G/P和NGF-G/P@Yoda1组在中后期的骨修复表现也进一步突显了Yoda1在修复过程中的重要作用。

为了验证NGF-G/P@Yoda1在体内的神经-血管-成骨协同效应，我们建立了皮下植入模型和股骨缺损模型。与之前的皮下植入模型研究一致，NGF-G/P@Yoda1在2周内促进了神经、血管和部分胶原纤维的早期生长。尽管Piezo1在骨骼系统之外的其他组织中广泛表达，并参与神经元分化和血管生成的调节，但G/P@Yoda1组的这一效应不如NGF-G/P@Yoda1组显著，这可能与Yoda1在中后期的主导释放有关。与体外结果一致，NGF的快速释放促进了早期神经纤维的生长，并增强了血管生成，从而建立了一个由早期神经-血管网络调节的微环境，促进神经递质如CGRP的释放和营养物质的运输，进而导致胶原纤维的早期沉积。在股骨缺损模型中，NGF-G/P@Yoda1组表现出广泛的血管和神经分布，以及明显的骨再生现象，这归因于NGF的早期快速释放和Yoda1在中后期的持续释放。值得注意的是，CD31和EMCN的高表达表明NGF-G/P@Yoda1有效地促进了类型H血管的形成。作为血管生成-成骨耦合的关键介导者，类型H血管在骨骼发育和骨再生中发挥着重要作用。本研究中，各组类型H血管的表达模式与成骨标志蛋白的表达模式相似，再次确认了类型H血管形成与成骨活动的紧密耦合关系。先前研究表明，CGRP介导的神经-细胞间通信活动和Piezo1介导的机械敏感信号均促进与骨稳态相关的类型H血管形成。本研究提供了进一步支持这一结论的证据。此外，本研究还发现，G/P@Yoda1和NGF-G/P@Yoda1组在8周时在骨缺损区域形成了皮质骨样结构，且骨吸收活动较低。这表明两个组均已进入骨重塑的后期阶段，骨小梁重建基本完成，这一发现与之前关于Piezo1介导骨重塑的研究结果一致。因此，本研究中开发的NGF-G/P@Yoda1复合水凝胶不仅模拟了骨损伤早期的神经血管重建，还缩短了骨再生和后续重塑过程，为临床难治性大型骨缺损提供了一种新的治疗策略。

尽管本研究提出的复合水凝胶-微球递送系统成功实现了早期神经介导的骨再生和后期机械转导驱动的骨重塑，但Yoda1作为一种Piezo1通道激动剂，可能带来意想不到的副作用，如局部血管失调、慢性疼痛或免疫失衡，因为Piezo1在血管、神经和免疫系统中广泛表达。在本研究中，尽管Yoda1在体内以极低剂量局部施用，但其潜在的脱靶效应和长期安全性仍是未来转化和工业应用的重要考虑因素。此外，尽管我们的研究在重复实验中保持了一致的结果，但在规模化生产过程中，Yoda1的合成和纯化复杂性、载体制备的标准化、以及药物装载过程的均匀性和长期稳定性，仍然是进一步的技术障碍。因此，在临床前阶段，必须严格评估药物释放动力学、生物分布、代谢特征和长期安全性，以确保该系统的安全性和有效性。监管批准将依赖于提供强有力的临床前证据，证明局部递送系统的安全性以及最低的全身暴露，从而确保其益处远大于潜在风险。此外，体内的生物力学测试确认，复合系统在手术后立即表现出与自体骨移植相当的机械性能。然而，其在更大、部分承重缺损中的有效性仍需进一步验证。值得注意的是，在临床病例中，大多数骨缺损治疗涉及内固定与自体骨移植的结合，其中机械支持主要由钢板或螺钉提供，而移植的自体骨则主要发挥生物和部分支持作用。因此，对于无法通过手术修复的大型骨缺损，机械强度并不是材料设计的首要考虑因素。然而，在未来旨在解决更大承重缺损的研究中，除了生物相容性、可制造性和生物功能外，提高机械性能也将成为重要考量。

综上所述，本研究开发了一种包含NGF和Yoda1的水凝胶-微球复合序贯递送系统。NGF的快速释放促进了RSC96的迁移和成熟，并诱导了PC-12向神经样表型分化。进一步研究显示，由少突胶质细胞和神经样细胞建立的微环境显著促进了BMSCs的成骨分化和HUVECs的血管生成。动物实验确认了NGF的快速释放能够启动和模拟骨缺损区域的早期神经血管化反应，而Yoda1的延迟释放则能够激活和维持Piezo1介导的中后期骨再生和重塑效果。本研究不仅揭示了神经调控与机械转导之间的协调作用，还通过序贯编程的生物材料递送，开创了骨组织工程中一种新的精准治疗策略。