《Experimental Neurology》：Effect of encephalomyosynangiosis procedure on post stroke recovery in a permanent model of ischemic stroke
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EMS手术通过自体颞肌移植促进小鼠永久性远端大脑中动脉阻塞后血管生成和神经保护，5天时梗死体积减少41%，30天改善局部脑血流和血管密度，认知功能测试显示学习记忆能力提升，但未显著改善皮质萎缩或运动功能。
安东尼·迪亚兹（Anthony Diaz）| 黛琳·加米奥特亚-图罗（Daylin Gamiotea-Turro）| 桑杰夫·库马尔·亚达夫（Sanjeev Kumar Yadav）| 凯坦·R·布尔萨拉（Ketan R. Bulsara）| 拉杰库马尔·维尔马（Rajkumar Verma）
美国康涅狄格大学健康科学学院神经科学系，法明顿，CT 06032
摘要
急性缺血性中风（AIS）仍然是全球致残的主要原因之一。目前针对AIS的治疗方法有限，主要依靠溶栓药物，但这些方法受到治疗窗口狭窄且缺乏神经保护作用的限制。AIS后受损或发育不良的血管系统以及较差的血管生成能力是神经保护治疗失败的重要原因。因此，迫切需要寻找能够促进血管生成和神经保护的新方法，以改善中风后的恢复情况。在本研究中，我们采用了一种间接的颅内旁路技术——脑肌膜血管形成术（Encephalomyosynangiosis，简称EMS），该技术通过将自体颞肌移植到缺血皮层上来刺激血管生成。EMS在烟雾病（moyamoya disease）的治疗中已被证明有效，我们推测它也可能在中风后促进持续的血管生成和功能恢复。我们在永久性大脑中动脉远端阻塞（dMCAo）发生4小时后，使用小鼠模型验证了EMS的治疗潜力。42只C57BL/6雄性和雌性小鼠被随机分为对照组、dMCAo组以及dMCAo+EMS组。通过测量梗死体积、脑灌注成像（激光散斑技术）、血管密度和炎症反应的免疫组织化学分析，以及开放场地测试、旋转棒测试和新物体识别任务等神经行为测试来评估实验结果。与dMCAo组相比，EMS组在中风后5天的梗死体积显著减少（28.5 ± 9.9% vs 49.3 ± 14.5%，p < 0.05）。在30天时，EMS组小鼠的脑灌注情况得到改善，血管密度增加，IBA1+细胞积累减少。虽然EMS未能显著减轻长期皮质萎缩或影响感觉运动功能，但在新物体识别任务中提高了学习和记忆表现。总之，EMS能够促进小鼠中风的血管生成、脑灌注和认知恢复。这些发现首次为EMS作为促进中风后血管修复和功能恢复的新手术策略提供了概念验证证据，值得进一步开展转化研究。
引言
中风是全球致残和死亡的主要原因之一，2019年至2020年间在美国造成的经济负担估计为560亿美元（Martin等人，2024年）。尽管取得了机械取栓和溶栓等进展，但目前的治疗方法仍受治疗窗口狭窄的限制，主要只能恢复血管完整的区域的血流。因此，血流灌注不良或结构受损的区域往往得不到治疗，导致永久性的功能缺陷（Balucani等人，2015年）。这些局限性凸显了开发能够促进缺血性中风后血管和神经元再生的新策略的必要性。
虽然大脑在中风后会启动血管生成和神经元再生反应，但由于血管成熟度低和神经元存活率有限，这些机制不足以实现完全恢复（Krupinski等人，1993年；Zhang等人，2000年）。临床前研究显示，如VEGF等促血管生成因子的药物输送具有潜力，但由于血管形成不稳定和出血风险增加，其临床应用受到阻碍（Zhang等人，2000年）。
脑肌膜血管形成术（EMS）是一种传统的颅内旁路技术，最初用于烟雾病的治疗，可为缺血组织提供血液供应的替代方案。临床上的颅内旁路方法主要有两种：直接法，即通过手术将头皮外的动脉（如 superficial temporal artery，STA）与皮层动脉连接以立即恢复血流；间接法，如将血管化的组织（如颞肌）放置在脑表面以刺激侧支血管的形成。直接旁路技术在临床应用中技术难度较大，尤其是在小鼠模型中更为复杂。此外，即使实施了这种手术，患者可能也没有足够的血管储备来承受手术所需的皮质分支阻塞（Kim等人，2016年；Nguyen等人，2022年）。因此，我们旨在本研究测试EMS作为中风治疗的潜在效果。在EMS手术中，我们将自体颞肌直接移植到皮层表面，从而刺激渐进且强烈的血管生成，显著减少了烟雾病患者的缺血事件（Kim等人，2016年；Nguyen等人，2022年）。先前的研究还表明，EMS能增强短暂性大脑中动脉阻塞（MCA）小鼠模型中的血管密度（Paro等人，2022年），这提示其在缺血性中风中也可能具有治疗作用。然而，EMS在缺血性中风中的效果尚未得到系统评估。一个可靠的临床前模型对于评估EMS作为中风治疗方法至关重要。常用的缺血模型（如短暂性近端MCA阻塞或血栓栓塞性MCA阻塞）通常会导致大面积梗死并伴有明显水肿，这些模型主要涉及皮质和皮下组织损伤，仅能反映15–25%的临床病例，因此不太适合评估皮质再血管化策略（Chamorro等人，1991年）。由于EMS专门针对皮质表面，我们采用了永久性远端MCA阻塞（dMCAo）模型，该模型更接近人类皮质中风的情况，从而增强了本研究的转化意义。
本研究首次在dMCAo模型中评估了EMS作为治疗策略的效果。我们探讨了EMS是否能够促进稳定的血管生成和神经保护，并评估了其对血流灌注、梗死体积、组织完整性和功能恢复的影响。我们的发现为EMS作为一种新的中风后恢复方法提供了概念验证证据，有望将其应用范围从烟雾病扩展到更广泛的脑血管疾病。
实验动物
实验动物
共从杰克逊实验室（Jackson Laboratory，缅因州巴港，Bar Harbor）获得了42只年轻的（2–3个月大）C57BL/6雄性和雌性小鼠（RRID: IMSR_JAX:000664）。小鼠被随机分为两组：（1）用于梗死分析的短期生存组；（2）用于脑血流、免疫荧光和行为分析的长期生存组。所有实验均获得了我们机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（ID AP-201045-0926）。小鼠被饲养在机构提供的环境中。
EMS减少dMCAo后的梗死损伤
我们在中风后5天评估了EMS手术对皮质梗死体积的影响（图1），发现与仅接受dMCAo处理的小鼠相比，EMS手术组的梗死体积显著减少（TTC法测量：28.5 ± 9.9% vs 49.3 ± 14.5%，p < 0.05）。这些数据表明EMS可能有助于减轻dMCAo模型中的皮质损伤。
EMS改善了梗死周围组织的脑灌注
我们使用激光散斑成像技术分析了梗死周围9个不同区域的脑灌注情况。
讨论
本研究表明，EMS在永久性dMCAo模型中能够促进血管和功能恢复。我们发现EMS减少了皮质梗死体积，改善了梗死周围的血流灌注，促进了血管生成并形成了稳定的血管网络，同时提高了学习和记忆能力，尽管对组织萎缩和运动恢复的影响有限。这些结果扩展了EMS的应用范围，表明其可能作为一种有效的手术治疗策略。
资金来源
本研究得到了美国德克萨斯州达拉斯市美国心脏协会（American Heart Association Inc Dallas TX）颁发的转化项目奖968187的支持（资助对象：拉杰库马尔·维尔马，Rajkumar Verma）。
CRediT作者贡献声明
安东尼·迪亚兹（Anthony Diaz）：撰写初稿，数据整理。
黛琳·加米奥特亚-图罗（Daylin Gamiotea-Turro）：数据可视化，正式分析。
桑杰夫·库马尔·亚达夫（Sanjeev Kumar Yadav）：实验设计，正式分析。
凯坦·R·布尔萨拉（Ketan R. Bulsara）：概念构思。
拉杰库马尔·维尔马（Rajkumar Verma）：撰写和编辑初稿，验证结果，监督研究，争取资金，概念构思。
致谢
所有动物实验均获得了美国康涅狄格大学健康科学学院动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。同时，我们也感谢科学编辑兼插图师Bernard L. Cook III的协助。
